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原文传递一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法

专利名称：	一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法
摘要：	一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法，涉及分析化学和纳米材料技术领域。首先合成稀土掺杂的UCNPs，将与靶标分子有特异性亲和的DNA1修饰在UCNPs上，采用与DNA1序列部分互补的核酸DNA2连接上荧光猝灭基团；通过碱基互补配对原则，使UCNPs与荧光猝灭基团之间的距离拉近，从而发生荧光能量共振转移诱导UCNPs发生荧光猝灭；加入检测样品后，检测样品中靶标分子优先与DNA1结合导致双链解离，使UCNPs与荧光猝灭基团距离增加，从而发生荧光恢复；通过检测UCNPs在980nm近红外光激发下的发光强度的变化，对照相应荧光强度标准线性图，定量检测样品中靶标分子的含量。
专利类型：	发明专利
申请人：	厦门大学
发明人：	任磊;王佳威;李丹阳
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010059675.9
公开号：	CN111175266A
代理机构：	厦门南强之路专利事务所(普通合伙)
代理人：	马应森
分类号：	G01N21/64;G;G01;G01N;G01N21;G01N21/64
申请人地址：	361005 福建省厦门市思明南路422号
主权项：	1.一种近红外荧光生物传感器的构建方法，其特征在于包括以下步骤： 1)制备UCNPs； 2)将UCNPs分散在含有盐酸的乙醇溶液中，超声去除UCNPs表面的油酸分子，对UCNPs进行表面改性； 3)在改性后的UCNPs表面修饰与靶标分子有特异性亲和的DNA1，制备UCNPs-DNA1； 4)构建UCNPs-DNA1与荧光猝灭基团的近红外荧光纳米生物传感器。 2.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤1)中，所述制备UCNPs的具体方法为：将0.5mmol的YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O与TmCl3·6H2O混合物加入1～5mL油酸和5～10mL 1-十八烯中，在50～100mL容器中搅拌均匀，在真空环境下加热反应，自然冷却至室温，再加入5mL含有NH4F和NaOH的甲醇溶液，搅拌加热以除去溶液中的甲醇，然后抽真空通氮气，梯度升温，并在氮气氛围下保温；待升温反应结束后自然冷却，离心，收集产物，重新分散在5～10mL环己烷溶剂中，加入2～5mL水/乙醇混合溶液，震荡后静置分层过夜，收集上层溶液，即得UCNPs，再分散于5～10mL环己烷溶剂中于4℃下保存备用。 3.如权利要求2所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法，其特征在于所述YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O、TmCl3·6H2O的配比为0.3635︰0.135︰0.15；YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O、TmCl3·6H2O混合物中n(Y3+):n(Yb3+):n(Tm3+)＝72.7︰27︰0.3；所述加热反应的温度为120～130℃，加热反应的时间为1～2h。 4.如权利要求2所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法，其特征在于所述甲醇溶液中NH4F和NaOH的配比为(1～4)︰(0.0625～0.25)；所述搅拌加热的温度可为80℃；所述梯度升温可升至280～310℃；所述在氮气氛围下保温的时间可为0.5～2h；所述离心可以8000～12000r/min离心10～30min；所述水/乙醇混合溶液中水和乙醇的体积比可为1︰1；所述震荡可震荡至少2次。 5.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤2)中，所述对UCNPs进行表面改性的具体方法为：取1～10mg油酸分子包裹的UCNPs，第一次离心后将离心产物分散于1～10mL含有盐酸的乙醇溶液中，超声去除UCNPs表面的油酸分子，然后第二次离心，弃去上清液，再将离心产物分散于3～10mL含有盐酸水乙醇溶液中纯化，再第三次离心后弃上清，将产物分散在1～10mL水中备用。 6.如权利要求5所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法，其特征在于所述第一次离心的速率为8000～12000r/min，第一次离心的时间可为10～30min；所述含有盐酸的乙醇溶液的pH可为2～5；所述超声的时间可为0.5～1h；所述第二次离心的速率可为8000～13000r/min，第二次离心的时间可为10～20min；所述第三次离心的速率可为8000～13000r/min，第三次离心的时间可为10～20min；所述水可采用超纯水；所述产物分散在水中的最终浓度1mg/mL。 7.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤3)中，所述制备UCNPs-DNA1的具体方法可为：取步骤2)所得的1mL水溶性UCNPs，加入不同浓度的DNA1水溶液，搅拌后离心，离心产物重分散在5～10mL的水或Tris-HCL缓冲液中；所述不同浓度的DNA1水溶液的浓度可为0.1～100μM；所述搅拌可400～600rpm搅拌6～24h；所述离心的速率可为8000～13000r/min，离心的时间可为10～20min；所述水可采用超纯水；所述Tris-HCL缓冲液可为20～50mM，5～50mM MgCl2，50～100mM NaCl，pH 7.4～8；Tris-HCL缓冲液优选20mM，5mM MgCl2，50mM NaCl，pH 7.4；所述DNA1通过5’末端官能化基团与稀土离子强配位作用修饰在UCNPs表面，所述DNA1的5’末端官能化基团包括但不局限于羧酸基团、磷酸基团、磺酸基团等中的一种；所述DNA1序列为：5’-TTTTTTTTTCTTGCCTACGCCACTAGCTC-3’或 5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。 8.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤4)中，所述构建UCNPs-DNA1与荧光猝灭基团的近红外荧光纳米生物传感器的具体方法可为：将UCNPs-DNA1溶液与荧光猝灭基团溶液以不同比例在Tris-HCL缓冲液中混合，总体积为200μL，然后置于37℃恒温摇床中反应，反应结束后，将溶液离心，将近红外荧光纳米生物传感器分散在1～5mL Tris-HCL缓冲液中；所述UCNPs-DNA1溶液与荧光猝灭基团溶液的摩尔比可为1︰(0.1～10)，优选1︰1；所述反应的时间可为1～3h；所述离心的速率可为8000～12000r/min，离心的时间可为10～20min；所述Tris-HCL缓冲液可为20～50mM，5～50mM MgCl2，50～100mM NaCl，pH 7.4～8，优选20mM，5mM MgCl2，50mM NaCl，pH 7.4；所述荧光猝灭基团包括但不局限于BHQ1、BHQ2、TAMRA、金纳米颗粒、氧化石墨烯等中的一种；所述荧光猝灭基团修饰有与DNA1部分互补的DNA2；所述DNA2序列为：5’-GTGGCGTAGGCAAGTTTTTTTTT-3’或5’-AGACAACACGTGCCCAAC-3’。 9.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法构制的近红外荧光生物传感器的检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1)绘制荧光强度标准线性图：配置5～50μL不同梯度浓度的靶标分子标准溶液加入100～200μL含有近红外荧光生物传感器的溶液中，震荡孵育形成检测溶液，在980nm近红外激光激发下测量检测上述不同梯度浓度的靶标分子标准溶液在特定波长处的荧光强度值，将其标准浓度与检测时荧光强度一一对应绘制成荧光强度标准线性图； 2)对样品进行检测：将检测样品分散在200μL Tris-HCL缓冲液中，然后将5～50μL检测样品加入100～200μL含有近红外荧光生物传感器的溶液中，震荡孵育形成检测溶液，在980nm近红外激光激发下测量检测溶液在特定波长处的荧光强度值，再对照相应的荧光强度标准线性图，定量计算样品中靶标分子的含量。 10.如权利要求9所述检测方法，其特征在于在步骤1)或2)中，所述震荡孵育的时间为30～60min；所述特定波长可选择波长540nm和806nm；在步骤2)中，所述Tris-HCL缓冲液可为20mM，5mM MgCl2，50mMNaCl，pH 7.4；本发明首先合成稀土掺杂的UCNPs；特别的，避开复杂的化学修饰步骤，通过最简单直接的方式将与靶标分子有特异性亲和的DNA1修饰在UCNPs上；采用与DNA1序列部分互补的核酸DNA2连接上荧光猝灭基团；通过碱基互补配对原则，使得UCNPs与荧光猝灭基团之间的距离拉近，从而发生荧光能量共振转移诱导UCNPs发生荧光猝灭；加入检测样品后，检测样品中靶标分子优先与DNA1结合导致双链解离，使得UCNPs与荧光猝灭基团距离增加，从而发生荧光恢复；通过检测UCNPs在980nm近红外光激发下的发光强度的变化，对照相应的荧光强度标准线性图；定量检测样品中靶标分子的含量。
所属类别：	发明专利