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原文传递一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用

专利名称：	一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用
摘要：	本发明属于电化学传感器技术领域，具体公开了一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用，其工作电极制备方法如下：将T型结构复合物(Ts)、燃料链F、靶序列T混合，得混合液，孵育得扩增产物；将捕获探针固定至金电极表面，再将扩增产物滴加到固定有捕获探针的金电极表面，制得熵驱动的链置换循环放大体系；将亚甲蓝(MB)与DNA纳米片混合反应得到MB‑DNS混合物，然后将DNS混合物滴加到金电极表面，孵育，得到DNA纳米片纳米分子放大检测体系，即完成所述工作电极的制备。本发明成功构建了一种DNS纳米分子和级联T型结构相结合的电化学传感器，用于检测外泌体miRNA，灵敏度高，反应速度快，稳定性和重现性好。
专利类型：	发明专利
申请人：	重庆医科大学
发明人：	颜玉蓉;刘萍;申波;李新民;丁世家
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T20:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010068436.X
公开号：	CN111175365A
代理机构：	上海光华专利事务所(普通合伙)
代理人：	尹丽云
分类号：	G01N27/327;G01N27/48;G;G01;G01N;G01N27;G01N27/327;G01N27/48
申请人地址：	400016 重庆市渝中区医学院路1号
主权项：	1.一种检测外泌体miRNA的电化学传感器的制备方法，所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极，其特征在于，所述工作电极的制备方法包括以下步骤： (1)金电极表面处理：将裸金电极表面处理干净，备用； (2)制备扩增产物：将T型结构复合物(Ts)、燃料链F、靶序列T混合，得混合液，孵育，得扩增产物； (3)将捕获探针固定至处理干净的金电极表面，再将步骤(2)所得的扩增产物滴加到固定有捕获探针的金电极表面，孵育，制得熵驱动的链置换循环放大体系； (4)将亚甲蓝(MB)与DNA纳米片(DNS)混合反应得到MB-DNS混合物，然后将MB-DNS混合物滴加到步骤(3)所得的金电极表面，孵育，得到DNA纳米片纳米分子放大检测体系，即完成所述工作电极的制备。 2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述T型结构复合物(Ts)采用DNA单链P、R、L1和L2制备而成。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述DNA单链P、R、L1和L2的摩尔比为1∶1∶1∶1；和/或，制备T型结构复合物(Ts)时，先将DNA单链P、R、L1和L2分别溶解于DNA杂交液中，再进行混合；和/或，所述单链P的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述单链R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或，所述单链L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；和/或，所述单链L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述燃烧链F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；和/或，步骤(2)中，所述靶序列T的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；和/或，步骤(2)中，混合液中靶序列T的终浓度≥65aM，优选为0.1fM-1nM，更优选为100pM；和/或，步骤(2)中，孵育时间≥30min，优选为30-90min，更优选为60min。 5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，序列如SEQ ID NO.7所示；和/或，步骤(3)中，所述捕获探针的浓度为100～1000nmol/L，优选为1000nmol/L；和/或，步骤(3)中，捕获探针固定在金电极表面上后，需采用MCH封闭非特异性吸附位点。 6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，DNA纳米片(DNS)的制备方法具体包括：将DNA单链1-9混合，退火得到DNA纳米片(DNS)。 7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述单链1-9的核苷酸序列如SEQ IDNO.8-SEQ ID NO.16所示。 8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(4)中，孵育反应时间为30-90min，优选为60min；和/或，步骤(3)和步骤(4)中，孵育温度为4-48℃，优选为37℃；和/或，步骤(2)中，所述T型结构复合物(Ts)末端凸出的胸腺嘧啶核苷数为2个；和/或，步骤(4)中，所述DNA纳米片(DNS)的浓度为0.5-1.5μM，优选为1μM。 9.一种采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的电化学传感器。 10.根据权利要求9所述的电化学传感器在检测外泌体miRNA上的应用。
所属类别：	发明专利