详情

原文传递一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体及其制备方法与应用

专利名称：	一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体及其制备方法与应用
摘要：	本发明公开了一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体及其制备方法与应用，属于纳米生物材料领域。该外泌体包括能用于质谱流式检测的重金属标签化合物，重金属标签化合物分布在外泌体内腔中；制备方法包括以下步骤：1)提取外泌体：通过梯度离心、浓缩，沉淀获取外泌体；或者通过超高速离心获得外泌体；2)重金属标签导入：步骤1)获得的外泌体与重金属标签化合物通过电穿孔及孵育方式，将重金属标签化合物导入外泌体中；3)获取具有重金属标签的外泌体：利用沉淀试剂盒或者超高速离心分离，去除没有被外泌体包裹的游离重金属标签化合物，获得用于质谱流式细胞仪检测的外泌体。本申请还提供所述外泌体的应用，实现高通量单细胞追踪外泌体的摄取。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广州医科大学
发明人：	王金恒;刘金保;涂成功;张慧;谢茂彬
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-22T00:00:00+0800
申请号：	CN201910588667.0
公开号：	CN110361442A
代理机构：	广州三辰专利事务所(普通合伙)
代理人：	范钦正
分类号：	G01N27/62(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	510180 广东省广州市越秀区东风西路195号
主权项：	1.一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体，其特征在于：包括能用于质谱流式检测的重金属标签化合物，所述重金属标签化合物分布在外泌体内腔中。 2.根据权利要求1所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体，其特征在于：所述重金属标签化合物是指包含有原子量在75-209间所有元素的化合物，所述重金属标签化合物可与细胞内蛋白、RNA、DNA中的至少一种相结合。 3.根据权利要求1所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体，其特征在于：所述重金属标签化合物为包含I127的碘去氧尿啶或碘化丙啶，含有Rh103或Ir191或Ir193的DNA插入剂，含有Pt194和Pt195的顺铂中的至少一种。 4.权利要求1-3任一项所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤： 1)提取外泌体：通过梯度离心、浓缩，沉淀获取外泌体；或者通过超高速离心获得外泌体； 2)重金属标签导入：步骤1)获得的外泌体与重金属标签化合物通过电穿孔及孵育方式，将重金属标签化合物导入外泌体中； 3)获取具有重金属标签的外泌体：利用沉淀试剂盒或者超高速离心分离，去除没有被外泌体包裹的游离重金属标签化合物，获得用于质谱流式细胞仪检测的外泌体。 5.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述梯度离心、浓缩，沉淀获取外泌体，其具体制备方法的步骤如下：将细胞在培养基中有血清培养2天，用PBS洗3次，后用无血清培养1-2天；收集培养基的上清液，对上清液依次采用300g×5min、2000g×5min离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片，再用0.22um滤膜去除凋亡小体，大囊泡，进一步使用100KD超滤管以1500g转速浓缩上清，去除大部分蛋白及小分子，沉淀试剂4℃过夜沉淀外泌体，1500g×30min去除上清，再次1500g×5min去除残余上清，PBS重悬后获得外泌体；步骤1)中所述通过超高速离心获得外泌体，其具体制备方法的步骤如下：将细胞在培养基中有血清培养2天，用PBS洗3次，后用无血清培养2天；收集培养基的上清液，对上清液依次采用300g×5min、3000g×5min、10000g×30min离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片以及大囊泡，而后通过100000g×70-90min得到含有外泌体的沉淀，PBS重悬后获得外泌体。 6.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述电穿孔及孵育的条件设置为：250 V，100ms，6次，电穿孔后37℃孵育30min。 7.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述沉淀试剂盒为ExoQuick沉淀试剂盒；具体沉淀试剂的沉淀步骤如下：利用沉淀试剂对上述外泌体进行4℃过夜沉淀，1500g×30min,去除上清，再次1500g×5min,使用PBS重悬外泌体，10000g×5min离心，将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除，上清即为具有重金属标签化合物的外泌体；步骤3)中所述超高速离心，具体步骤如下：外泌体进行100000g×70-90min离心得到含有外泌体的沉淀，PBS重悬后，再经过10000g×5min离心，将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除，上清即为具有重金属标签化合物的外泌体。 8.权利要求1-3任一项所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用，其特征在于：用于高通量的单细胞分析外泌体的摄取。 9.根据权利要求8所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用，其特征在于：所述高通量的单细胞分析外泌体的摄取的方法，具体步骤为： (1)将上述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体加入细胞中或注射至动物体内，收集或者分离细胞； (2)对细胞进行金属标签抗体的孵育，使抗体与细胞表面或内部的抗原结合； (3)通过离心和PBS清洗将未结合的抗体去除，而后用质谱流式细胞仪高通量地检测单细胞中75-209原子量元素的含量，从而来判断细胞的具体类型以及其对外泌体的摄取情况。 10.根据权利要求9所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用，其特征在于：步骤(2)中所述金属标签抗体，其对应抗原是包含有可以被质谱流式细胞仪所检测的原子量在75-209的元素；这些金属标签需要每一种标签对应标记一种抗体，不可重复。
所属类别：	发明专利