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原文传递一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒及其使用方法

专利名称：	一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒及其使用方法
摘要：	本发明公开了生物化学相关技术领域的一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒及其使用方法，包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、发光底物、清洗液和质控品；采用以磁微粒子作为免疫反应的固相，利用化学发光酶联免疫分析方法与化学发光类测定仪器配合，用于测定人体血清中的降钙素原含量；并且可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本，实现降钙素原的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，反应时间非常快、精确度和检测效率有了较大的提高。
专利类型：	发明专利
申请人：	江苏泽成生物技术有限公司
发明人：	金鑫;刘振世;耿青;俞佩佩;赵佳杰
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010124910.6
公开号：	CN111175492A
代理机构：	上海联科律师事务所
代理人：	赵旭
分类号：	G01N33/543;G01N33/533;G01N33/535;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/543;G01N33/533;G01N33/535
申请人地址：	214400 江苏省无锡市江阴市东盛西路6号(扬子江生物医药加速器A4-1)
主权项：	1.一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、发光底物、清洗液和质控品；所述抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成： Sa1：用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液； Sa2：按照降钙素原抗体:异硫氰酸荧光素溶液的质量比为1:1.1～1:1.5的比例将所述降钙素原抗体与所述异硫氰酸荧光素溶液充分混匀； Sa3：用pH为8～9的碳酸盐缓冲液将Sa2制得的产物调节平衡； Sa4：将Sa3制得的产物用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的降钙素原包被抗体；所述抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成： Sb1：用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液； Sb2：将所述降钙素原抗体和碱性磷酸酶的反应基团分别活化后，按照所述碱性磷酸酶与所述降钙素原抗体的摩尔比为1:1～1:3的比例，在催化剂的催化下充分混匀进行充分的偶联反应； Sb3：用pH为8～9的Tris缓冲液平衡将Sb2制得的产物调节平衡； Sb4：将Sb3制得的产物用凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，制得碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体；所述磁微粒试剂通过包括以下步骤的操作制得： Sc1：将羧基磁珠浓缩液充分混匀置于磁场中15～20min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清； Sc2：向Sc1制得的羧基磁珠中加入所述羧基磁珠的体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min，再置于磁场中15～20min，待所述羧基磁珠全部沉降后吸去上清；然后重复本步操作0～3次； Sc3：用所述磁微粒缓冲液将所述羧基磁珠定容到10～50mg/mL； Sc4：按照所述羧基磁珠:抗异硫氰酸荧光素抗体为100:(1～2)的比例，向Sc3制得的溶液中加入所述抗异硫氰酸荧光素抗体，保持混匀状态下2～8℃反应16～20h，制得磁珠-抗体溶液； Sc5：在磁场中将所述磁珠-抗体溶液中的溶质完全沉降后，用所述磁微粒缓冲液清洗0～3次后再用磷酸缓冲液将所述溶质定容为8～12mg/mL；所述发光底物通过包括将ALPS溶解于所述ALPS体积4～10倍的发光底物缓冲液中的操作制备而成；所述质控品通过包括用质控品缓冲溶液溶解降钙素原抗原的操作制备而成。 2.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：Sa2和Sb2的操作中，至少有一处在避光条件下进行。 3.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：Sb4后还包括Sb5：从所述碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体中筛选出效果最优的分子片段进行测试。 4.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：所述抗试剂A或者所述抗试剂B中还包括含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液，所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，所述表面活性剂占所述磷酸盐缓冲液体积的0.01～0.5％。 5.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：所述质控品缓冲溶液通过在1L的新生牛血清中加入0.01～0.05g的四环素和0.1～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解并经过0.22μm滤膜处理制备而成。 6.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：所述抗试剂缓冲液为pH值为5～6的PBS体系；所述抗试剂缓冲液包括纯化水1L、Na2PO3H·12H2O10～20g、NaPO3H2·12H2O1～2g、绵羊血清1～5g、新生牛血清3～10g和马血清1～5g。 7.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：所述清洗液通过包括以下步骤的操作制备而成：将NaCl160g、KCl4g、三羟甲基氨基甲烷24.2g和吐温201mL溶于900mL双蒸水中，调节PH至7.4，再用双蒸水定容至1000mL并稀释15倍。 8.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：所述磁微粒缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分：Tris12.12～15.26mg、NaCl5.82～8.58mg和甲基纤维醚50～60g。 9.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒，其特征在于：所述发光底物缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分：Tris12.12～121.14g、NaCl5.82g、光泽精0.03g；所述发光底物缓冲液的pH为9.5。 10.一种如权利要求1～9任一项所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤： Sd1：取二支试管，分别加入100μL所述质控品、100μL待测样本； Sd2：向每支试管中加入60μL所述抗试剂A和60μL所述抗试剂B，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置于42℃下水浴5min； Sd3：向每支试管中加入60μL所述磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置42℃下水浴1min； Sd4：将试管在磁分离器上沉淀3min，缓慢地倒转试管和磁分离器，倒出上清液；把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； Sd5：向每支试管中加入300μL所述清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； Sd6：重复Sd5的操作0～3次； Sd7：把所有试管从磁分离器上取下，向每支试管中加入200μL所述发光底物，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。
所属类别：	发明专利