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原文传递一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒

专利名称：	一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒
摘要：	本发明公开了一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，包括A液和B液，所述A液为样品处理液，B液为量子点荧光探针，样品处理液的成分为碱溶液；本发明同时公开了所述真菌量子点荧光免疫检测试剂盒的制备方法及使用方法；本发明中采用量子点偶联葡聚糖多克隆抗体代替CFW染色剂，实现了对真菌的特异性检测，荧光探针采用葡聚糖高亲和抗体制备，避免了因CFW特异性结合能力差引起的假阳性或假阴性，大大提高了真菌检出率、准确率；量子点具有激发光谱宽、发射光谱窄的特点，可见光可激发使其发出荧光，可实现在光学显微镜直接镜检，无需加装荧光模块或使用荧光显微镜，降低了对检测人员技术及实验室检测仪器的要求。
专利类型：	发明专利
申请人：	济南德亨医学科技有限公司
发明人：	姚丛丛;王振亚
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN202010131679.3
公开号：	CN111208294A
分类号：	G01N33/569;C07K16/44;C07K16/06;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;G;C;G01;C07;G01N;C07K;G01N33;C07K16;C07K1;G01N33/569;C07K16/44;C07K16/06;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22
申请人地址：	250000 山东省济南市天桥区蓝翔中路30号时代总部基地H8号楼107、202
主权项：	1.一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，包括A液和B液，其特征在于，所述A液为样品处理液，B液为量子点荧光探针，样品处理液的成分为碱溶液。 2.根据权利要求1所述真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，按照如下步骤进行制备：（1）葡聚糖多克隆抗体制备（1.1）免疫原制备：使用过碘酸盐氧化法对β-葡聚糖进行BSA/OVA修饰；（1.2）动物免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清；（1.3）间接ELISA法测定抗血清效价:用碳酸盐缓冲液稀释抗原至5~10ug/ml作为包被液，4℃包被过夜后弃去；洗脱液洗涤三次，封闭液37℃封闭1h后弃去，用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，37℃显色15min后终止；测定450nm吸光度值，将吸光度值为0.3的抗血清/多克隆的稀释倍数作为其效价；（1.4）多克隆抗体的获得：抗血清献一次用50%和33%饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶Protein A亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体，最后用十二烷基苯磺酸钠-聚苯稀酰胺凝胶电泳进行鉴定。（2）量子点荧光探针的制备采用EDC偶联法标记抗体，将量子点溶液和EDC溶液按照按1:10比例混合，并常温避光活化；然后加入过量待标记抗体，调整反应pH值为6，避光反应1h；将反应结束的液体进行超滤，在10000rpm下离心20min，吸出超滤后的标记抗体，用含20mM Tris、15%蔗糖、1%BSA，pH7.5的溶液复溶至原体积，即为制备好的量子点标记抗体；（3）样本处理液的配制：配制一定量浓度为0.01mol/L的氢氧化钾水溶液；（4）液体分装。 3.根据权利要求2所述真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，按照如下步骤进行制备：（1）葡聚糖多克隆抗体制备（1.1）免疫原制备：使用过碘酸盐氧化法对β-葡聚糖进行BSA/OVA修饰；（1.2）动物免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清；（1.3）间接ELISA法测定抗血清效价:用碳酸盐缓冲液稀释抗原至6-9ug/ml作为包被液，4℃包被过夜后弃去；洗脱液洗涤三次，封闭液37℃封闭1h后弃去，用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，37℃显色15min后终止；测定450nm吸光度值，将吸光度值为0.35的抗血清/多克隆的稀释倍数作为其效价；（1.4）多克隆抗体的获得：抗血清献一次用50%和33%饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶Protein A亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体，最后用十二烷基苯磺酸钠-聚苯稀酰胺凝胶电泳进行鉴定。（2）量子点荧光探针的制备采用EDC偶联法标记抗体，将量子点溶液和EDC溶液按照按3:20比例混合，并常温避光活化；然后加入过量待标记抗体，调整反应pH值为7，避光反应1h；将反应结束的液体进行超滤，在10000rpm下离心20min，吸出超滤后的标记抗体，用含20mM Tris、15%蔗糖、1%BSA，pH8.0的溶液复溶至原体积，即为制备好的量子点标记抗体；（3）样本处理液的配制：配制一定量浓度为0.01mol/L的氢氧化钾水溶液；（4）液体分装。 4.根据权利要求3所述真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，按照如下步骤进行制备：（1）葡聚糖多克隆抗体制备（1.1）免疫原制备：使用过碘酸盐氧化法对β-葡聚糖进行BSA/OVA修饰；（1.2）动物免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清；（1.3）间接ELISA法测定抗血清效价:用碳酸盐缓冲液稀释抗原至7-8ug/ml作为包被液，4℃包被过夜后弃去；洗脱液洗涤三次，封闭液37℃封闭1h后弃去，用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，37℃显色15min后终止；测定450nm吸光度值，将吸光度值为0.4的抗血清/多克隆的稀释倍数作为其效价；（1.4）多克隆抗体的获得：抗血清献一次用50%和33%饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶Protein A亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体，最后用十二烷基苯磺酸钠-聚苯稀酰胺凝胶电泳进行鉴定。（2）量子点荧光探针的制备采用EDC偶联法标记抗体，将量子点溶液和EDC溶液按照按1:5比例混合，并常温避光活化；然后加入过量待标记抗体，调整反应pH值为7，避光反应1h；将反应结束的液体进行超滤，在10000rpm下离心20min，吸出超滤后的标记抗体，用含20mM Tris、15%蔗糖、1%BSA，pH8.5的溶液复溶至原体积，即为制备好的量子点标记抗体；（3）样本处理液的配制：配制一定量浓度为0.01mol/L的氢氧化钾水溶液；（4）液体分装。 5.一种如权利要求1-4任一所述的真菌量子点荧光免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）挑取样本制成涂片，干燥后充分固定；或者将组织切片按常规脱蜡至水化；（2）将标本放于水平位置，加一滴A覆盖于标本上，后加一滴B液覆盖于标本上；（3）保持染色2分钟，用滤纸吸去多余的染液，于荧光显微镜下观察。
所属类别：	发明专利