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原文传递基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法

专利名称：	基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法
摘要：	本发明公开了基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶‑1（PARP‑1）单粒子检测方法，本发明还公开了一种免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒。基于纳米粒子散射光谱位移的变化实现了对PARP‑1活性的定量检测和在单粒子水平上对细胞内的PARP‑1进行暗场成像，从而显著区分癌细胞和正常细胞。本发明通过使用白光作为光源结合暗场显微镜和单粒子散射光谱仪，可以实现对单个等离子纳米粒子的暗场成像和散射光谱的采集，相比传统的平均测量手段具有更高的检测灵敏度。本发明的试剂盒具有免标记、检测灵敏度高、空间分辨率较高等优点。
专利类型：	发明专利
申请人：	东南大学
发明人：	卫伟;张多多;刘松琴
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T20:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T17:00:00+0805
申请号：	CN201911325620.1
公开号：	CN111024624A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	王艳
分类号：	G01N21/25;G;G01;G01N;G01N21;G01N21/25
申请人地址：	211102 江苏省南京市江宁区东南大学路2号
主权项：	1.基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤： Au50的制备； Au50-dsDNA的制备； 3）Au8的制备； 4）在Au50-dsDNA中加入NAD+和含有PARP-1的待测溶液中扩增，然后取样滴加在氨基功能化的玻璃片上，静电吸附后，洗去未结合的探针，加入过量的Au8，静电吸附后，洗去未结合的Au8，在暗场显微镜下采集图像和利用光谱仪采集单粒子的光谱曲线，根据位移的变化来确定PARP-1的浓度。 2.根据权利要求1所述的基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述Au50的合成步骤如下： S1）通过柠檬酸三钠还原法制备粒径为13nm的金纳米粒子：将柠檬酸三钠溶液快速加入搅拌中且沸腾的氯金酸溶液，混合溶液颜色依次从黄色到无色，再变为黑色、紫色，最终为酒红色，继续搅拌并保持沸腾，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中储存备用； S2）通过种子生长法制备粒径为50nm的金纳米粒子：将超纯水、新鲜制备的 Au13、NH2OH·HCl溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液依次加入圆底烧瓶中，然后室温下将氯金酸逐滴加入上述混合溶液中并剧烈搅拌，停止搅拌后室温放置，最后所制得的Au50于4℃冰箱中储存备用。 3.根据权利要求1基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述Au50-dsDNA的合成步骤如下： A1）首先，将BSPP加入到Au50溶液中，在室温搅拌下孵育过夜，然后混合物离心后，沉淀复溶于超纯水，向溶液中加入少量BSPP，摇晃均匀后获得Au50-BSPP； A2）其次，将Au50-BSPP与s-DNA混合，然后在室温下轻轻搅拌后，每隔3 h加NaCl，使其最终盐浓度达到150 mM得到Au50溶液； A3）将SH-PEG-800加入上述Au50溶液中并孵育1 h，然后加入c-DNA轻轻摇晃2 h，最后进行离心得到Au50-dsDNA。 4.根据权利要求1所述基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述Au8的合成步骤如下： B1）将氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵在室温下连续搅拌； B2）滴入硼氢化钠，溶液颜色由藏红花黄色变为橙红色，表明成功制备了Au8。 5.一种免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Au50-dsDNA、NAD+和Au8。 6.根据权利要求5所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括氨基功能化的玻璃片。 7.根据权利要求5所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述NAD+浓度为1-10μM。 8.根据权利要求5~7任一项所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述癌细胞为卵巢癌A2780细胞或人乳腺癌MCF-7细胞。
所属类别：	发明专利