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原文传递一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法

专利名称：	一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法
摘要：	本发明公开了一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，包括以下步骤：S1、利用植物原生质体制备总蛋白，再将总蛋白超滤后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品；S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析。该方法从没有细胞壁保护的原生质体中提取蛋白质更容易且原生质体更利于保持蛋白与小肽的完整性，不仅操作简单，而且测定结果中假阳性率更低。
专利类型：	发明专利
申请人：	湖南农业大学
发明人：	肖浪涛;苏益;罗为桂
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN201911372695.5
公开号：	CN111060696A
代理机构：	广州嘉权专利商标事务所有限公司
代理人：	肖云
分类号：	G01N33/68;G16B50/00;G16B20/00;G;G01;G16;G01N;G16B;G01N33;G16B50;G16B20;G01N33/68;G16B50/00;G16B20/00
申请人地址：	410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路1号
主权项：	1.一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：包括以下步骤： S1、利用植物原生质体提取总蛋白，再将总蛋白超滤后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品； S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析；其中，所述数据的分析过程包括以下步骤：利用ProteinLynx ProteinPilot软件分析质谱原始数据，自动计算色谱峰宽和质谱峰宽；利用Paragon Algorithm算法结合ProteinPilot与TAIR蛋白数据库检索蛋白；利用SignalP5.0在线软件分析所鉴定小肽是否含有信号肽剪切位点。 2.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：数据分析操作还包括：将蛋白序列比对到Gene Ontology Terms数据库，鉴定蛋白的功能；利用NCBI“blastp”蛋白同源比对将已鉴定蛋白注释到TAIR protein database数据库；利用KEGG数据库对所鉴定蛋白进行通路分析；利用COG数据库进行基因的功能注释。 3.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述步骤S1还包括通过以下步骤提取得到原生质体：取待提取材料，加入酶液反应完后过滤，收集滤液，离心后弃上清，沉淀即为原生质体；其中，所述酶液的制备方法为取含有质量分数为(0.5％～2％)的纤维素酶、质量分数为(0.05％～0.15％)的果胶酶、质量分数为(0.05％～0.15％)的离析酶和(0.3～0.6)mol/L甘露醇的溶液，在(50～60)℃下水浴(8～15)min冷却后加入氯化钙和BSA，所述氯化钙的终浓度为(0.05～0.15)mol/L和所述BSA在溶液中的质量百分数为(0.05％～0.15％)。 4.根据权利要求3所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：加酶液后的反应条件为：在室温下避光轻微摇动4h。 5.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述步骤S1中提取蛋白总样的操作具体为：用质量分数为(6～10)％的甘露醇溶液洗涤后，再用PBS重悬原生质体，加入PMSF混匀后离心，收集上清即为原生质体总蛋白。 6.根据权利要求1至5任一项所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述步骤S2利用液质联用仪进行检测过程中，液相色谱部分使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为2％乙腈/0.1％甲酸/98％H2O和流动相B为98％乙腈/0.1％甲酸/2％H2O。 7.根据权利要求6所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述检测过程包括通过梯度洗脱程序对肽段进行洗脱分离。 8.根据权利要求7所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述梯度洗脱程序为：0～4min 96％A～94％A，4～100min 94％A～76％A，100～102min 76％A～60％A，102～105min 60％A～20％A，105～110min 20％A，110～110.1min 20％A～95％A，110.1～120min95％A。 9.根据权利要求1至5任一项所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述质谱检测过程中，质谱条件为：毛细管电压3.0kV；温度120℃；采样锥60V；反溶剂温度350℃；流速50L/h；反溶剂气体流速500L/h；扫描在250ms内获得，以50ms/次进行扫描；在350-1500m/z范围内采集MS1光谱，在100-1500m/z范围内采集MS2光谱。
所属类别：	发明专利