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原文传递基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法和应用

专利名称：	基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法和应用
摘要：	本发明属于电化学生物传感器领域，涉及妥布霉素的检测，特别是指基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法和应用。当被检测物与适配体结合时，引发链1（T1）被释放，该引发链能够引发EXOⅢ辅助的核酸链循环，并产生大量的引发链2（T2）。随后，在T2的作用下，发夹探针H2和H3被相继打开，从而发生CHA反应，产生大量的H2‑H3复合物，该复合物能够与通过PolyA固定在电极表面的信号探针进行杂交，使得电化学信号降低，从而达到对目标物进行定量的目的。本方法操作简便，条件温和，灵敏度高，线性范围宽。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	郑州大学
发明人：	邹丽娜;李贝贝;王伟航
专利状态：	有效
申请日期：	2021-12-11T00:00:00+0800
发布日期：	2022-03-01T00:00:00+0800
申请号：	CN202111510911.5
公开号：	CN114113264A
代理机构：	郑州优盾知识产权代理有限公司
代理人：	冉珊敏
分类号：	G01N27/327;G;G01;G01N;G01N27;G01N27/327
申请人地址：	450001 河南省郑州市高新区科学大道100号
主权项：	1.基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）分别配制适配体链Apt、T1链、发夹探针H1、发夹探针H2和H3以及双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液；（2）将表面羧基化的Fe3O4磁珠活化，经磁分离后去除上清，PBS洗脱后加入适配体链Apt缓冲溶液，振荡过夜反应后进行磁分离，去除上清后再加入T1链的缓冲溶液，经振荡过夜反应后进行磁分离，去上清、洗脱后，加入PBS重悬完成Fe3O4纳米磁珠的修饰；（3）向步骤（2）的经修饰的Fe3O4纳米磁珠悬浮液中加入不同浓度的妥布霉素溶液/待测样品溶液，经振荡反应后进行磁分离，取上清液，向其中加入EXOⅢ水溶液、发夹探针H1缓冲溶液，继续反应结束后经高温灭活、冷却后再加入发夹探针H2缓冲溶液、发夹探针H3缓冲溶液，再反应得待检测反应体系；（4）在玻碳电极表面沉积AuNPs，然后滴加步骤（1）配制的双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液至电极表面，反应结束后用MCH封闭液封闭电极表面未修饰的活性位点得修饰后的电极，将步骤（3）得到的待检测反应体系滴加至电极表面反应后，再进行DPV测定电化学信号，通过检测步骤（3）得到的不同浓度的妥布霉素溶液的待检测反应体系对应的DPV信号强度，建立浓度与电信号强度变化之间的线性关系方程式；（5）将步骤（4）中的待检测反应体系替换为步骤（3）的待测样品溶液的待检测反应体系，测得的DPV信号强度代入步骤（4）的线性方程，即为待检测样品溶液中的妥布霉素浓度。 2.根据权利要求1所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中适配体链Apt的序列如SEQ ID No.1所示，其3'端与氨基相连；T1碱基序列如SEQ ID No.2所示；发夹探针H1碱基序列如SEQ ID No.3所示；发夹探针H2碱基序列如SEQ ID No.4所示；发夹探针H3碱基序列如SEQ ID No.5所示；双链DNA探针C1-C2中的C1碱基序列如SEQ ID No.6所示、C2碱基序列如SEQ ID No.7所示，其5'端与二茂铁相连。 3.根据权利要求2所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述适配体链Apt和T1链的缓冲溶液是用PBS缓冲液稀释至1μM；发夹探针H1的缓冲溶液是用TM缓冲液稀释至500nM；发夹探针H2和H3的缓冲溶液是用TM缓冲液分别稀释至1μM；双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液包括单链DNA探针C1的TE缓冲液和单链DNA探针C2的TE缓冲液。 4.根据权利要求3所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中适配体链Apt缓冲溶液的体积为200μL，振荡反应的温度为37℃；T1链的缓冲溶液的体积为200μL；PBS重悬所用的PBS缓冲溶液的体积为200μL。 5.根据权利要求3所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中Fe3O4纳米磁珠悬浮液与不同浓度的妥布霉素溶液/待测样品溶液的反应体积均为10μL。 6.根据权利要求5所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中EXOⅢ水溶液的浓度为2U/μL，体积为10μL；发夹探针H1、H2和H3的缓冲溶液的体积均为20μL。 7.根据权利要求5所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中反应的温度为37℃，高温灭活的温度为85℃、时间为30min。 8.根据权利要求1所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液是将2μM的单链DNA探针C1和C2的缓冲溶液等体积混合后，37℃振荡过夜得到的；MCH封闭液的浓度为1mM。 9.根据权利要求1-8任一项所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中经过DPV测定电化学信号的电极表面探针的再生方法为将经过DPV测定电化学信号的电极用超纯水清洗后，在将单链DNA探针C2缓冲溶液滴至清洗后的电极表面，37℃孵育2h，完成电极表面探针的再生过程。 10.权利要求1-8任一项所述的妥布霉素双放大检测方法在高灵敏检测妥布霉素中的应用，其特征在于：对于妥布霉素检测的线性范围为1-300nM，检出限为0.11nM。
所属类别：	发明专利