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原文传递一种HCV核心蛋白的CHA放大反应体系及超灵敏可视化检测方法

专利名称：	一种HCV核心蛋白的CHA放大反应体系及超灵敏可视化检测方法
摘要：	本发明提供了一种HCV核心蛋白的CHA放大反应体系及超灵敏可视化检测方法，涉及分析化学技术领域。本发明所述CHA放大反应体系包括B‑H2功能化纳米纤维膜，序列C7，序列I，探针H1，谷胱甘肽，第一缓冲液和第二缓冲液，利用所述CHA放大反应体系检测HCV核心蛋白时，该放大反应既避免了蛋白为诱导物在纤维膜上诱导CHA放大效率不高的缺点，也保证了HCV核心蛋白的无酶、无标记、可视化及特异性识别，可视化检测到低至10‑13mg/mL的HCV核心蛋白，而且还展现了高特异性、良好的重复使用性和长期稳定性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	四川;51
申请人：	四川大学
发明人：	周翠松;尹翠云;李晓玲;肖丹
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910237326.9
公开号：	CN109884304A
代理机构：	北京高沃律师事务所
代理人：	吕纪涛
分类号：	G01N33/576(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	610000 四川省成都市一环路南一段24号
主权项：	1.一种HCV核心蛋白的CHA放大反应体系，其特征在于，包括B-H2功能化纳米纤维膜，序列C7，序列I，探针H1，谷胱甘肽，第一缓冲液和第二缓冲液；所述序列C7的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述序列I的序列如SEQ ID NO.3所示，所述序列H1的序列如SEQ ID NO.4所示；所述第一缓冲液为含H2O2的MES缓冲液；所述第二缓冲液为含HAuCl4的MES缓冲液。 2.根据权利要求1所述CHA放大反应体系，其特征在于，所述B-H2功能化纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：(1)将聚苯乙烯和四丁基溴化铵混合后溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，得PS/TBAB/DMF溶液；所述聚苯乙烯和所述四丁基溴化铵的质量为所述PS/TBAB/DMF溶液质量的15～25％； (2)将所述PS/TBAB/DMF溶液进行静电纺丝，烘干后得PS纳米纤维膜；所述静电纺丝时的电压为10～20kV，进样速度为0.15～0.45mL/h，接收距离为7～15cm，收集时间为1.5～3h； (3)利用介质阻挡放电产生的大气压空气等离子体处理所述PS纳米纤维膜，得处理后的PS纳米纤维膜；所述处理的电压为40～50 V，电流为1.2～2.5A，放电处理时间为1～3min； (4)将所述处理后的PS纳米纤维膜浸泡于亲和素溶液中0.5～1.3h，取出后清洗，然后再与B-H2溶液反应0.6～1.5h，清洗后得B-H2功能化的纳米纤维膜；所述B-H2为经生物素标记的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 3.根据权利要求2所述CHA放大反应体系，其特征在于，步骤(1)所述四丁基溴化铵在所述PS/TBAB/DMF溶液的质量体积比为0.1～0.5％。 4.根据权利要求2所述CHA放大反应体系，其特征在于，步骤(1)所述溶解时伴随搅拌，所述搅拌的时间为20～28h。 5.根据权利要求2所述CHA放大反应体系，其特征在于，步骤(2)所述烘干的温度为75～85℃，烘干的时间为3.2～4.5h。 6.根据权利要求2所述CHA放大反应体系，其特征在于，步骤(2)得所述PS纳米纤维膜后，还包括对所述PS纳米纤维膜进行修剪。 7.根据权利要求2所述CHA放大反应体系，其特征在于，步骤(4)所述亲和素溶液的浓度为2～5μM。 8.根据权利要求2所述CHA放大反应体系，其特征在于，步骤(4)所述B-H2溶液的浓度为1～2.5μM。 9.一种非治疗目的的HCV核心蛋白检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求8所述CHA放大反应体系中的序列C7和序列I退火杂交，得杂交链C7-I； (2)将所述杂交链C7-I与HCV核心蛋白反应2～5h，得反应体系； (3)将所述B-H2功能化纳米纤维膜浸泡于所述反应体系中，进行CHA放大反应，得反应后的纳米纤维膜； (4)将所述反应后的纳米纤维膜清洗后，与血红素溶液反应，得DNAzyme/纳米纤维膜； (5)清洗所述DNAzyme/纳米纤维膜后，置于96孔板底部，添加第一缓冲液反应0.3～0.8h后，添加第二缓冲液反应0.25～0.5h，然后添加谷胱甘肽，通过溶液颜色变化判断HCV核心蛋白的存在；若所述溶液为红色，HCV核心蛋白不存在，若所述溶液由红色向蓝色突变，则存在HCV核心蛋白。
所属类别：	发明专利