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原文传递一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法

专利名称：	一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法
摘要：	本发明公开一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法。本发明在4‑MBA标记的金纳米颗粒表面包裹一层聚多巴胺，形成金‑PDA‑银卫星结构的SERS标记，利用金银纳米粒子间的缝隙具有独特的局域表面等离子体共振极大的放大SERS标记的拉曼信号；同时，本发明利用酶切循反应结合磁性捕获机制进一步放大SERS信号，实现对miRNA快速的高灵敏定量检测。本发明操作简单，检测稳定性好，检测灵敏度高；操作时只需将酶切循环反应后的孵育液依次加入到功能化磁性纳米颗粒中反应，再与SERS标记反应，反应结束后通过磁分离可马上进行检测，从而实现快速定量检测；可应用于早期癌症的临床诊断筛查。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	华南师范大学
发明人：	胡勇军;江宁静;朱挺锋;余萌;张文建;王棋
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810299791.0
公开号：	CN108535236A
代理机构：	广州市华学知识产权代理有限公司 44245
代理人：	崔红丽
分类号：	G01N21/65(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N21;G01N21/65
申请人地址：	510631 广东省广州市天河区中山大道西55号华南师范大学生物光子学研究院
主权项：	1.一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)选用4‑MBA作为拉曼信号分子，通过该分子一端‑SH与金纳米颗粒结合，反应完全加入DA溶液，通过多巴胺氧化自聚合反应在金纳米颗粒表面形成PDA壳层；(2)将步骤(1)中包裹后的SERS标记金纳米颗粒用等体积银氨溶液混合，通过PDA表面丰富的儿茶酚基团和氨基基团原位吸附银离子并原位还原为银纳米颗粒，得到金‑PDA‑银卫星结构的SERS标记；(3)将特异性识别miRNA的发卡结构适配体和不同浓度的miRNA标准样品液混合反应，miRNA特异性打开发卡结构适配体，裸露出与桥接DNA互补的碱基序列Ⅲ；加入桥接DNA，使碱基序列Ⅲ与桥接DNA形成杂交DNA双链后，再加入剪切酶，剪切酶特异性识别双链的特定位点，剪切桥接DNA成为两段，从发卡结构适配体中游离出来；剪切完毕后发卡结构适配体的碱基序列Ⅲ区域又裸露出来，再与体系中桥接DNA互补配对，剪切反应循环，体系中切断的桥接DNA在循环反应中随miRNA的增加而增加；酶切循环放大反应完毕，加热使酶失活；(4)将表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒用活化剂活化羧基，加入与桥接DNA的3′端互补配对的‑NH2适配体Aptamer S1，反应完成用Tris‑Ac清洗3遍，得到适配体功能化磁性纳米颗粒；(5)将步骤(3)中酶切循环反应的溶液加入步骤(4)中的适配体功能化磁性纳米颗粒中孵育，通过碱基互补配对形成捕获探针；(6)将步骤(5)中的捕获探针与步骤(2)的金‑PDA‑银卫星结构的SERS标记混合，随着步骤(3)中miRNA的增加，切断的桥接DNA数目随之增加，切断的桥接DNA会封闭功能化磁性纳米颗粒上的适配体Aptamer S1，不会与SERS标记结合，磁分离之后上清液拉曼信号较强；而miRNA加入量较少时，完整的桥接DNA含量多，桥接DNA与功能化磁性纳米颗粒上适配体Aptamer S1互补配对后，桥接DNA上仍存在部分裸露的碱基序列，裸露的碱基序列会与SERS标记中PDA空位通过π‑π共轭结合，磁分离后，上清液拉曼信号较低；(7)根据miRNA浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对miRNA进行定量检测。
所属类别：	发明专利