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原文传递用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法

专利名称：	用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法
摘要：	用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法，属于微生物生态技术领域。本发明利用珠磨法提取白酒大曲或酒醅样品基因组DNA，通过设计常见酿酒微生物中酵母的通用DGGE引物，PCR扩增酵母核糖体中的种特异性DNA片段，DGGE电泳分离不同种属的对应的DNA片段，切胶回收优势微生物对应的条带，再次PCR扩增及连接T载体和阳性克隆的挑选，DGGE电泳重新比对后，进行测序鉴定切胶条带对应的微生物信息。本发明采用不依赖于培养的分子技术，具有简便、快速、灵敏等特点，本方法为发现、鉴别白酒大曲或酒醅中酵母群落结构提供了检测方法，进而为开发不同香型白酒风味定向的酿酒功能微生物提供了参考依据。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江南大学
发明人：	高亦豹;徐岩;王海燕
专利状态：	有效
申请日期：	2009-06-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN200910033060.2
公开号：	CN101570786
代理机构：	无锡市大为专利商标事务所
代理人：	时旭丹;刘品超
分类号：	C12Q1/68(2006.01)I
申请人地址：	214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院
主权项：	1、用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法，其特征是步骤为： a)选择用于待鉴定的样品——白酒大曲或酒醅，并采用珠磨法提取样品中所有微生物的基因组DNA； b)选用酵母26S rRNAD1区基因扩增的引物对，并在引物对的正向引物的 5’端加上GC发夹结构；引物对为： NL1-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3’， LS2：5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’； c)以步骤a)中的基因组DNA为模板进行PCR扩增；酵母PCR条件为：用NL1-GC、LS2通用引物进行酵母26S rDNA D1区片段的扩增，25μL反应体系包括2.5μL的10×Buffer，2μL的25mmol/L dNTP混合物，1U Taq DNA聚合酶，每种引物25pmol，DNA模板用量为10ng，双蒸水补足25μL；PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃1min、65℃1min、72℃1min 进行30个循环；最后72℃延伸10min； d)将PCR扩增产物在DGGE电泳上进行分离：电泳仪器为Bio-rad公司的 Dcode基因突变检测系统；酵母DGGE电泳条件为电压100V，60℃下电泳 200min，丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度为10％-50％，由7mol/L尿素和质量浓度40％去离子甲酰胺组成的水溶液作为100％变性剂； e)染色后将DGGE胶上优势条带进行切胶回收：染色方法为使用 1×SYBR-Green染色45min，染色分三次进行；切胶回收方法为：优势条带切割后放入灭过菌的离心管中，加入60μL的灭菌去离子水清洗，后加入60μL的灭菌去离子水并于4℃静置过夜； f)切胶条带重新PCR扩增后连接T载体、转化入大肠杆菌、挑选阳性克隆； PCR扩增采用的引物与步骤b)所述的引物相同；扩增程序与步骤c)所述的扩增程序相同； g)重新DGGE比对：使用步骤c)中的PCR产物及步骤f)中挑选阳性克隆对应的PCR产物进行DGGE比对； h)比对正确的PCR产物对应的阳性克隆子进行测序，测序结果到Genbank 上比对；获得白酒大曲或酒醅酵母群落的结构。
所属类别：	发明专利