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原文传递一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法

专利名称：	一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法
摘要：	一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法将免疫酶联吸附技术、酪胺信号放大技术以及修饰有不同生物分子的金纳米颗粒发生聚集现象三者结合起来，建立了一种用于检测微量前列腺特异性抗原(PSA)等蛋白质的实验方法。本方法将针对待测蛋白质(如PSA)的一种抗体固定于基片表面，捕捉样品中的待测蛋白质后，孵育待测蛋白质(如PSA)的另一种带有辣根过氧化物酶(HRP)活性的抗体。HRP在一定条件下，催化biotin-tyramide产生生物素沉积。利用生物素标记的DNA修饰的金纳米颗粒与链酶亲和素修饰的金纳米颗粒发生聚集的现象，进一步放大信号，再经过银染。最后，使用软件对实验结果进行数据分析。该方法具有极低的检测限和较宽的检测范围，能够在成分复杂的兔血清中实现对抗原的检测，具有重要的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	首都医科大学
发明人：	张玉祥;沈海滢
专利状态：	有效
申请日期：	2010-06-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201010210949.6
公开号：	CN101943703A
分类号：	G01N33/68(2006.01)I
申请人地址：	100069 北京市右安门外西头条10号
主权项：	一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法，其特征是步骤为：(1)在固相上利用双抗体夹心法捕捉待测蛋白质；(2)利用酪胺信号放大技术在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积；(3)金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集及银染实验；(4)扫描及数据分析。(1)在固相上利用双抗体夹心法捕捉PSA或其它目标蛋白质：利用免疫酶联吸附方法捕捉PSA等蛋白质并使之结合上有辣根过氧化物酶活性的抗体；例如，将PSA单克隆抗体稀释成一定浓度的溶液，各取1μL点于环氧基基片上，置于温箱中，37℃抽真空过夜后，将基片取出，在反应池中加入10％的BSA溶液封闭，室温封闭5h后，用PBST溶液清洗。然后在基片上粘贴围栏，用兔血清稀释PSA标准品，将其浓度依次稀释为5fg/μL，2.5fg/μL，125ag/μL，6.25ag/μL和330.5zg/μL，各取20μL将一系列浓度的PBS溶解的PSA标准品加入到围栏内，于4℃孵育过夜。孵育过夜后，将基片取出，用PBST溶液清洗，之后，加入PBS稀释的PSA另一种具有辣根过氧化物酶活性的单克隆抗体，孵育一段时间后，用PBST溶液清洗。(2)利用酪胺信号放大技术在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积：加入biotin?tyramide溶液，在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积；在基片上加入biotin?tyramide溶液，对照组不加入biotin?tyramide溶液，反应一段时间后用PBST溶液清洗。(3)金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集及银染实验：不同生物分子修饰的金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集并使用银染方法进一步放大信号；利用巯基与金纳米颗粒的相互作用，将biotin标记的DNA修饰到金纳米颗粒表面，利用蛋白质与金纳米颗粒的静电吸附作用将链霉亲和素修饰到金纳米颗粒表面，从而制备出两种不同生物分子修饰的金纳米颗粒。在放置有基片的反应池中加入一定量的链霉亲和素修饰的金纳米颗粒(SA?AuNP)，孵育一段时间。PBST清洗后，再向反应池中加入一定量的biotin标记的DNA修饰的金纳米颗粒(biotin?DNA?AuNP)，孵育一段时间。之后用PBST清洗，重复上述金纳米颗粒孵育过程，孵育结束后对基片进行银染。将银染试剂A液和B液混合，加入到放置有基片的反应槽中，浸泡一段时间，取出，清洗后，加入一定浓度的硫代硫酸钠溶液，浸泡2min，清洗后，烘干。(4)扫描及数据分析；将芯片烘干后，置于扫描仪上扫描，图像结果使用ImageJ分析其灰度值，然后用Origin软件进行数据分析。
所属类别：	发明专利