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原文传递基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法

专利名称：	基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法
摘要：	本发明提供一种用于检测DNA与蛋白质相互作用的方法，所述方法基于解旋酶，通过DNA分子长度的变化，确定蛋白质在发卡DNA上的结合位点。与现有技术相比，本发明的方法为单分子操作，直观反映蛋白质分子和DNA分子的相互作用；本方法的精确率很高，达到一个碱基对；本发明的方法还可以检测DNA与蛋白质的各个结合位点的结合强度的强弱；所述方法所需要的DNA和蛋白质的用量很少。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国科学院物理研究所
发明人：	滕翠娟;徐春华;李明
专利状态：	有效
申请日期：	2018-05-09T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-19T00:00:00+0800
申请号：	CN201810437177.6
公开号：	CN110470844A
代理机构：	北京泛华伟业知识产权代理有限公司
代理人：	李渤;郭广迅
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100190 北京市海淀区中关村南三街8号
主权项：	1.一种基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法，所述方法包括以下步骤： 1)根据所检测的蛋白质设计DNA分子；其中，所述DNA分子包含发卡结构和两个双链DNA手柄，所述发卡上含有解旋酶结合位点，两个双链DNA手柄的末端分别修饰地高辛和生物素，并且所述解旋酶的解旋方向是解旋发卡DNA的方向； 2)将步骤1)得到的DNA分子与链霉亲和素修饰的顺磁性小球溶液混匀，使DNA分子修饰生物素的手柄与顺磁性小球连接，获得DNA分子与顺磁性小球的组合体；其中，1μL 50pmol的DNA分子使用1～50μL浓度为10mg/ml的磁性小球混匀； 3)将步骤2)获得的DNA分子与顺磁性小球的组合体放入磁镊装置的样品池中，所述样品池的表面耦合抗地高辛，使得所述组合体连接到样品池的表面；利用微流泵向样品池中加入解旋酶，并对DNA分子施加6～8pN的拉力，得到第一信号； 4)将步骤2)获得的DNA分子与顺磁性小球的组合体放入磁镊装置的另一样品池中，所述样品池的表面耦合抗地高辛，使得所述组合体连接到样品池的表面；利用微流泵向样品池中加入待检测的蛋白质，然后加入解旋酶，对DNA分子施加6～8pN的拉力，得到第二信号； 5)比较第一信号和第二信号，得到蛋白质在发卡DNA上的结合位置。 2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，两个双链DNA手柄的末端分别修饰10～30个地高辛和10～30个生物素；优选地，两个双链DNA手柄的末端分别修饰18个地高辛和18个生物素。 3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2)中，1μL 50pmol的DNA分子使用10μL浓度为10mg/ml的磁性小球混匀。 4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，使样品池的表面耦合抗地高辛包括以下步骤：在样品池中加入DNA分子与顺磁性小球的组合体之前，向样品池中加入100μL的1mg/ml的抗地高辛溶液，孵育2小时，使抗地高辛耦合在样品池表面。 5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，所述解旋酶与DNA分子的摩尔比为0.1～10:1000；更优选地为1:1000。 6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，所述待检测的蛋白质与DNA分子的摩尔比为200000:0.1～10；更优选地，所述待检测的蛋白质与DNA分子的摩尔比为200000:1。 7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，加入待检测的蛋白质后，孵育5分钟。 8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤5)中，将结合位置和DNA序列进行对应，得到DNA结合蛋白在DNA上的结合位点和具体的结合序列。 9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括使用倒置显微镜观测顺磁性小球的位置，以表征DNA分子的长度变化；优选地，所述方法还包括通过DNA分子长度的变化来测量DNA与蛋白质相互作用中各个结合位点的结合强度的强弱。 10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括通过发卡DNA分子长度的变化确定发卡DNA与蛋白质结合位点的初始位置和/或末端位置。
所属类别：	发明专利