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原文传递从微量样品中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用

专利名称：	从微量样品中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用
摘要：	本发明涉及一种从微量组织中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用。所述方法包括：向组织样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述蛋白变性剂为可适用于质谱上机鉴定的质谱兼容性变性剂；将裂解后的组织样品进行超声处理；向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。该方法操作简单，可提升样本中蛋白质的提取量，增加蛋白质的鉴定和定量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	深圳华大生命科学研究院
发明人：	任艳;范徉;梁莉媛;林志龙;张可人;李思奇;刘斯奇
专利状态：	有效
申请日期：	2018-02-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201810146491.9
公开号：	CN110161155A
代理机构：	北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	赵天月
分类号：	G01N30/06(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	518083 广东省深圳市盐田区盐田街道北山工业区综合楼
主权项：	1.一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，其特征在于，包括：向样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述蛋白变性剂为可适用于质谱上机鉴定的质谱兼容性变性剂；将裂解后的组织样品进行超声处理；向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声处理为接触式超声处理，优选为探针超声处理；所述超声处理的时间为1～2分钟，功率为40～100W；任选地，所述超声处理按照超声2～3秒，停止2～3秒重复。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白变性剂为RapiGest或脱氧胆酸钠；任选地，所述RapiGest的质量浓度为1～5％，所述脱氧胆酸钠的质量浓度为1～5％，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(PMSF)。 4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述可挥发的碱性试剂为第一弱碱试剂，所述第一弱碱试剂包括选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；任选地，所述第一弱碱溶液为碳酸氢铵。 5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，加入所述还原剂后在45～65℃条件下，温育30分钟～2小时；任选地，所述还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦溶液；任选地，所述二硫苏糖醇溶液的作用浓度为5mM～10mM，所述三(2-羧乙基)膦溶液的作用浓度为5mM～10mM。 6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，加入烷基化试剂后在室温避光放置30分钟～45分钟；任选地，所述烷基化试剂为碘乙酰胺或甲基甲硫甲基亚砜溶液；任选地，所述碘乙酰胺溶液的作用浓度为20mM～40mM，所述甲基甲硫甲基亚砜溶液的作用浓度为20mM～40mM。 7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，在加入胰蛋白酶酶解之前加入第二弱碱试剂，所述第二弱碱试剂包括选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；任选地，所述第二弱碱试剂为碳酸氢铵。 8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述酶解的条件为37℃下水浴4～8小时；任选地，所述胰蛋白酶的浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL；任选地，所述胰蛋白酶为测序级的胰蛋白酶；任选地，所述酸性试剂选自甲酸(FA)、三氟乙酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种；任选地，所述方法可适用于低至0.1μg蛋白样品的提取和消化；任选地，所述微量样品为组织样品或者细胞样品，优选为切片组织样品或穿刺组织样品。 9.一种对微量样品中提取的肽段进行定量检测的方法，其特征在于，将权利要求1～8任一项所述的肽段溶液利用液相色谱-质谱联用进行非依赖性数据(DIA)检测。 10.一种用于从微量组织中提取和消化蛋白质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂套装，所述试剂套装包括：试剂A，所述试剂A为裂解液，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述蛋白变性剂为RapiGest或脱氧胆酸钠，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(PMSF)，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述可挥发的碱性试剂选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种，试剂B，所述试剂B为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦溶液，试剂C，所述试剂C为碘乙酰胺或甲基甲硫甲基亚砜MMTS溶液，试剂D，所述试剂D为胰蛋白酶溶液，当试剂B为二硫苏糖醇溶液时，试剂C为碘乙酰胺溶液，当试剂B为三(2-羧乙基)膦溶液时，试剂C为甲基甲硫甲基亚砜溶液；任选地，所述试剂套装进一步包括试剂E，所述试剂E为酸性试剂，所述酸性试剂选自甲酸(FA)、三氟乙酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种；任选地，所述试剂套装进一步包括试剂F，所述试剂F选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；任选地，所述RapiGest的质量浓度为1～5％，所述脱氧胆酸钠的质量浓度为1～5％；任选地，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为5mM～10mM，所述三(2-羧乙基)膦溶液的作用浓度为5mM～10mM；任选地，所述碘乙酰胺溶液的作用浓度为20mM～40mM，所述甲基甲硫甲基亚砜溶液的作用浓度为20mM～40mM；任选地，所述胰蛋白酶溶液的作用浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL。
所属类别：	发明专利