详情

原文传递地黄根发育过程中大量差异代谢产物的鉴定方法

专利名称：	地黄根发育过程中大量差异代谢产物的鉴定方法
摘要：	本发明涉及LC‑MS的非靶向代谢组学方法发现地黄根三个不同发育阶段的差异代谢物，是通过不同代谢产物的变化积累模式来显示地黄根的发育和品质。本发明包括以下步骤：1.3个发育阶段地黄材料收集；2.质量控制（QC）样品的制备；3.LC/MS分析;4.数据预处理和统计分析;5.鉴定差异代谢物。本发明方法的优点在于通过基于LC‑MS的非靶向代谢组学方法预先鉴定了434种差异代谢物，其中有281个代谢物在三个比较分析组（ER/TR，TR/MR和ER/MR）中是不重复的。这些特定的代谢产物可能成为质量评估和确定收获期的潜在指标，显示了这种方法的高效性。差异代谢物为评估地黄根的质量和确定其收获时间提供了关键信息，这可能在医学的进一步应用中具有实际用途。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南师范大学
发明人：	周延清;杨珂;杨献光;段红英;王向楠;张丹丹
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201811018642.9
公开号：	CN108918726A
代理机构：	新乡市平原智汇知识产权代理事务所(普通合伙) 41139
代理人：	路宽
分类号：	G01N30/02(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02
申请人地址：	453007 河南省新乡市牧野区建设东路46号
主权项：	1. 地黄根发育过程中大量差异代谢产物的鉴定方法，包括 3个发育阶段地黄材料收集、质量控制（QC）样品的制备、 LC / MS分析、数据预处理和统计分析、鉴定差异代谢物，其特征在于：所述3个发育阶段地黄材料收集：在河南温县种植的“金九 (03‑2)”品种地黄作为试验材料，分别在2016年5月20日，8月20日和11月10日分别收集其伸长（E），膨胀或增厚（T）和成熟（M）3个发育阶段的根，将这些样品标记为伸长根（ER），扩大或增厚根（TR）和成熟根（MR）；所述质量控制（QC）样品的制备：将精确称重的100mg样品转移到1.5mL Eppendorf管中，向其中加入两个小钢球，在每个样品中加入20μL内标的甲醇、水（1/1，v / v）和1mL甲醇与水的混合物（7/3，v / v），将所有样品放置‑80℃至2分钟，然后将样品在60Hz下研磨2分钟，涡旋运动2分钟，并在环境温度下超声30分钟，并在4℃下放置10分钟，样品在14000rpm和4℃下离心10分钟，使用晶体注射器收集来自每个管的随后的上清液（500μL），然后通过0.22μM的过滤器过滤并转移到LC小瓶中，将其储存在‑80°C随后进行LC‑MS分析，质量控制（QC）样品是通过混合所有样品的等分试样制备的一个汇集样品；所述LC / MS分析：UHPLC系统，与LTQ OrbitrapMS（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）偶联的Ultimate 3000‑Velos Pro，用于执行和分析ESI正离子和负离子模式中的代谢谱，在前一种模式中，代谢物的分离是在2.1×100mm ACQUITYTM1.7μmBEH C8色谱柱上进行的，流动相含有0.1％甲酸（A）和乙腈（B）的水，线性洗脱梯度程序如下：5％B保持1.0分钟，线性增加至100％B 24分钟，然后保持4分钟，100‑5％B保持28.0至28.1分钟，5％B持续28.1至30分钟，每个运行时间持续30分钟，在负离子模式下，代谢物分离在2.1×100mm ACQUITYTM1.8μmHSS T3柱上进行，流动相含有6.5mM碳酸氢铵水溶液（C）和6.5mM碳酸氢铵在95％甲醇中和水（D），线性洗脱梯度程序为5％D保持1.0 min，然后线性增加至100％D18 min，保持4 min，100‑5％D保持22.0至22.1 min，5％D保持22.1至25.0分钟，每个运行时间持续25分钟；流速设定为0.35mL / min，柱温保持在50℃，注射量为5μL，质谱检测设定如下：正离子和负离子模式的毛细管温度分别为350℃和360℃，相应的喷雾电压为3.5kV和3.0kV，质量扫描范围为50至1000 m / z， MS的分辨率设置为30000.在整个分析过程中定期注射QC（每10个样品一次），以提供一组可重复性的可靠的评估数据；所述数据预处理和统计分析：从UHPLC‑LTQ Orbitrap获得的质谱数据在XCMS软件中进行分析，该软件产生了与保留时间、精确质量数和色谱相关的特征矩阵，两组中至少有80％的变量被提取出来，保留QC样品中相对标准偏差（RSD）小于30％的变量，进行进一步的多元数据分析，这些分析对于长时间的UHPLC‑LTQ分析足够稳定，从数据集中删除内部峰，使用Microsoft Excel 2007软件（Microsoft，Washington，USA）将所得数据标准化为每个样品的总峰面积；将主成分分析（PCA），偏最小二乘判别分析（PLS‑DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS‑DA）结果导入SIMCA（v14.0，Umetrics，Umea，Sweden） DA）中进行，Hotelling的T2区域（在模型的分数图中显示为椭圆）定义了建模变化的95％置信区间，模型的质量由R2X或R2Y和Q2术语的值来描述，R2X或R2Y被定义为由模型解释的数据中的方差的比例，因此表示拟合的优度，Q2被定义为由模型预测的数据中的方差比例，因此表示通过交叉验证程序计算的可预测性，在SIMCA中进行默认的七轮交叉验证，以确定主要组件的最佳数量，并避免模型过度拟合数据， OPLS‑DA模型也通过置换分析（n = 200次运行）进行验证；所述鉴定差异代谢物：差异代谢物的选择基于从OPLS‑DA模型获得的统计上显著的VIP阈值（投影变量影响）和归一化峰面积的双尾Student's t‑检验的P值的组合，我们使用由中国科学院大连化学物理研究所和大连化学数据解决方案信息技术有限公司合作开发的代谢组学研究中小分子识别一步法解决方案，由中国科学院大连化学物理研究所和大连化学数据解决方案信息技术有限公司共同编制的参考资料数据库，以及HMDB在线数据库（http://www.hmdb.ca/spectra / ms / search）和METLIN（https://metlin.scripps.edu/）， HMDB数据库搜索的质量公差设置为0.005 Da，自行构建的代谢物LC‑MS / MS鉴定系统是鉴定化合物的有效技术。
所属类别：	发明专利