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原文传递一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法

专利名称：	一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法
摘要：	本发明公开了一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法，其原理是草酰乙酸与衍生剂反应后，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，紫外检测器测定其含量。本发明的方法需用到的高效液相色谱仪精密度高，可以检测到微克级别的含量，检测灵敏度高。本发明的方法样本前处理过程简单易操作。本发明的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本低。本发明的方法的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，每一个样品测试时间短。本发明的相对于生物免疫检测方法，价格优势明显，所需试剂基本无毒。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	苏州科铭生物技术有限公司
发明人：	王黔;赵林川
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810900518.9
公开号：	CN108645936A
分类号：	G01N30/02(2006.01)I;G01N30/06(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/06
申请人地址：	215000 江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园A3楼101B室
主权项：	1.一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1仪器和用品的准备；准备高效液相色谱仪、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；所述高效液相色谱仪包括耐水C18柱和紫外检测器；步骤2试剂的配制；1）试剂一：在超纯水中加入盐酸，混匀后加入 EDTA，混匀；2）试剂二：在超纯水中加入 NaOH，混匀；3）试剂三：在超纯水中加入盐酸苯肼，混匀；4）试剂四：在超纯水中加入磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，混匀；5）试剂五：0.5mg草酰乙酸标准品置于1.5 mL EP管中，2‑8℃保存；步骤3实验前的准备工作；1）将超纯水800 mL和甲醇500 mL采用0.45μm水系滤膜和0.45μm有机系滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱；2）流动相的配制：将磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶于超纯水中，配置成流动相A；流动相B为纯甲醇；由体积比为95%的所述流动相A和5%的所述流动相B配置成流动相；3）将配好的所述流动相超声30分钟，以脱去所述流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；步骤4草酰乙酸的提取；称取0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入一支EP管内，在4℃下浸提60min，采用离心率10000g，4℃下离心10min，提取上清液；步骤5草酰乙酸的衍生反应；取250μL的上述上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，在25℃下反应30min，取样上高效液相色谱仪测定；步骤6标准品的配制；在试剂五中加入1mL超纯水，配成500μg /mL的母液，将所述母液用超纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL的草酰乙酸标准品溶液；不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液均按照上述衍生条件反应，反应结束后取适量上高效液相色谱仪检测；步骤7 仪器的调试和预设；1）开启电脑、泵和紫外检测器，安装上耐水C18柱，打开软件，在方法组中设置进样量，流速，柱温，波长以及走样时间，设置完毕保存方法组；2）用所述流动相过耐水C18柱的柱子，待基线稳定后开始加样；步骤8样本的测定；1）在耐水C18柱中分别加入不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液10μL，利用紫外检测器记录不同浓度的所述草酰乙酸标准品的峰面积，用于计算标准曲线；2）在上述耐水C18柱中加入样品10μL，利用紫外检测器在草酰乙酸衍生物的相应保留时间处检测草酰乙酸衍生物的峰面积；步骤9 草酰乙酸含量的计算；以所述草酰乙酸标准品溶液浓度为横坐标，所述草酰乙酸标准品溶液的峰面积为纵坐标计算草酰乙酸标准曲线；将样品峰面积代入所述所述草酰乙酸标准曲线，计算样品中草酰乙酸含量。
所属类别：	发明专利