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原文传递液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法

专利名称：	液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法
摘要：	本发明公开一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：(1)样本前处理：对尿液样本用阴离子交换固相萃取进行前处理，得到供试品溶液；(2)采用液质联用检测所述供试品溶液：色谱条件采用反相C18亲水色谱柱；采用梯度洗脱；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测。本发明还公开液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的内标定量检测方法。本发明的方法是首次建立了尿液样本中cAMP液相色谱串联质谱检测法，能够有效检出尿液样本中cAMP，具有分离效果好，基线平稳，检测时间短，线性好，准确度高，重现性好，灵敏度高，精密度高的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海药明奥测医疗科技有限公司
发明人：	李月杰;李伟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-03T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910265327.4
公开号：	CN110068645A
代理机构：	上海浦一知识产权代理有限公司
代理人：	郑权
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200131 上海市浦东新区自由贸易试验区富特北路211号
主权项：	1.一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)样本前处理：对尿液样本用阴离子交换固相萃取进行前处理，得到供试品溶液； (2)采用液质联用检测所述供试品溶液：其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相C18亲水色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.005～100mM乙酸盐水溶液，所述乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠中的一种或多种；流动相B为乙腈、或甲醇、或乙腈与甲醇的混合液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在0％～20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由0％～20％增至20％～90％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由20％～90％递增至90％～100％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％～100％递减至0％～20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为0％～20％；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测。 2.一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的内标定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)溶液配置和样本前处理：配制一系列浓度梯度的cAMP标准溶液及一定浓度的cAMP内标溶液；用阴离子交换固相萃取对添加cAMP内标溶液的尿液样本进行前处理，得到供试品溶液；用阴离子交换固相萃取对分别添加cAMP内标溶液的一系列浓度梯度的cAMP标准溶液进行前处理，得到一系列的对照品溶液； (2)采用液质联用检测所述供试品溶液和对照品溶液：其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相C18亲水色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.005～100mM乙酸盐水溶液，所述乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠中的一种或多种；流动相B为乙腈、或甲醇、或乙腈与甲醇的混合液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在0％～20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由0％～20％增至20％～90％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由20％～90％递增至90％～100％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％～100％递减至0％～20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为0％～20％；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测； (3)定量测定方法：将所述对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图；将对照品溶液中cAMP对其内标物的峰面积的比值与cAMP浓度进行线性回归产生标准曲线和/或拟合方程，或由质谱软件系统自动生成标准曲线和/或拟合方程；将供试品溶液中cAMP对其内标物的峰面积的比值代入至所述标准曲线和/或拟合方程，计算得到尿液样本中cAMP浓度，或由质谱软件系统给出样本中cAMP浓度。 3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述尿液样本经上样、淋洗，然后用体积分数10-30％甲酸水溶液洗脱，收集的洗脱液用碱中和后，得到供试品溶液。 4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～1mM；优选的，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～0.5mM；更优选的，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～0.05mM。 5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由20％递增至40％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由40％递增至90％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％递减至20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为20％。 6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，色谱柱为ACQUITYHSS T3 1.8μm,2.1mm×50mm。 7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱的柱温为20-45℃；优选的，柱温为25～35℃；更优选的，柱温为25℃；液相色谱的进样量为0.5～50μL；优选的，进样量为1～10μL；更优选的，进样量为2～5μL；液相色谱的流动相的流速为0.3～2mL/min。 8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，质谱条件设置，驻留时间为0.079s，锥孔电压为20V，碰撞能量为30V，定性离子对为cAMP：330.0→119.2，cAMP-IS：359.1→147.8，定量离子对为cAMP：330.0→136.2，cAMP-IS：359.1→164.7。 9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，一系列浓度梯度的cAMP标准溶液的浓度分别为：1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。 10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，cAMP内标溶液浓度为0.005～0.5nmol/mL；优选的，cAMP内标溶液浓度为0.005～0.5nmol/mL。
所属类别：	发明专利