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原文传递一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法

专利名称：	一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法
摘要：	本发明提供了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，该方法包括：利用高效液相串联质谱仪检测至少三个标准溶液得到相应色谱图，标准溶液中含浓度已知的多种维生素及其内标物；根据标准溶液中各个维生素与其内标物的浓度比值、相应色谱图中两者的峰面积比值，拟合得到各个维生素的标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品，并加入浓度已知的多种内标物，经样品前处理以得到待测样品；在相同检测条件下检测待测样品得到其色谱图；将该色谱图中各个维生素与其内标物的峰面积比值，代入到相应标准曲线方程，并根据所添加的其内标物的浓度，计算出待检测血液中各个维生素的含量。本发明能够同时检测血液中多种脂溶性维生素的含量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	许丽;雒琴;贾永娟;倪君君
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910630180.4
公开号：	CN110208438A
代理机构：	济南信达专利事务所有限公司
代理人：	李世喆
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市北京经济技术开发区经海六路5号院14号楼1层、2层、3层、5层、6层、7层
主权项：	1.一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，其特征在于，包括：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测N个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的至少两种脂溶性维生素及其内标物，不同标准溶液中同一脂溶性维生素的浓度不同，且N≥3；以标准溶液中，一脂溶性维生素的浓度与其内标物的浓度的比值为一二维坐标，以及以该标准溶液的色谱图中，该脂溶性维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值为另一二维坐标，拟合得到该脂溶性维生素的标准曲线方程，从而得到各种脂溶性维生素的标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品；将一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品；利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图；将所述待测样品的色谱图中，一脂溶性维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值，代入到该脂溶性维生素的标准曲线方程中，并根据所添加的其内标物的浓度，计算出所述待检测血液中该脂溶性维生素的含量，从而得到所述待检测血液中各种脂溶性维生素的含量；其中，第i种脂溶性维生素的标准曲线方程为：yi＝ki×xi+bi，其中，yi表征峰面积比值，xi表征浓度比值，ki和bi均表征系数。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测条件包括：液相条件和串联质谱条件；其中，所述液相条件包括：色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm，流动相为含体积比为0.05％-0.25％甲酸的甲醇水溶液和含体积比为0.05％-0.25％甲酸的甲醇乙腈溶液，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为85：15，甲醇乙腈溶液中甲醇与乙腈的体积比为3：1，分析时间为8.0min，柱温为25℃-33℃，进样量为10μL-30μL，流速为0.55mL/min-0.65mL/min；其中，所述串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源APCI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，温度为300℃，气帘气压力为20psi，碰撞气流速为5μL/min，离子喷雾电压为5500V，雾化气压力为25psi。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相条件还包括：Poroshell 120 EC-C18色谱柱；和/或，所述液相条件包括：柱温为30℃；和/或，所述液相条件包括：流速为0.6mL/min；洗脱过程为：甲醇水溶液和甲醇乙腈溶液的百分用量比，在3.1min-6.5min的洗脱时间范围内为0：100，在其他洗脱时间范围内为100：0。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两种脂溶性维生素包括：维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2中的至少两种。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2时，所述N个标准溶液中25-羟基维生素D2的浓度包括：3.906ng/mL、7.8125ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL中的至少三个；和/或，所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D3时，所述N个标准溶液中25-羟基维生素D3的浓度包括：12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL中的至少三个；和/或，所述至少两种脂溶性维生素包括维生素K1时，所述N个标准溶液中维生素K1的浓度包括：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL中的至少三个；和/或，所述至少两种脂溶性维生素包括维生素K2时，所述N个标准溶液中维生素K2的浓度包括：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL中的至少三个。 6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品，包括：用移液枪移取一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，置于离心管中，再加入50μL-300μL所述血液样品，再加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合2min-5min；涡旋混合后在离心管中加入一定量的萃取试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合3min-10min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min；移取一定量离心后的上清液至离心管中，并转移至氮气吹干装置上以将上清液吹干；对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min，得到待测样品。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3，且不包括维生素K1和/或维生素K2时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈水溶液至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min；或，所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3，且包括维生素K1和/或维生素K2时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min，再移取一定量的纯水至离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min；或，所述至少两种脂溶性维生素不包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min。 8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述内标工作液的移取量为10μL；和/或，所述沉淀蛋白试剂为乙醇，乙醇的用量为100μL-500μL；和/或，所述萃取试剂为正己烷，正己烷的用量为800μL-1200μL。 9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少两种脂溶性维生素的种类数为6；在所述分别检测N个标准溶液之前，进一步包括：利用移液器移取90μL第一标准工作液、10μL第二标准工作液和10μL所述混合内标工作液至离心管中，其中，第一标准工作液中含有浓度已知的维生素A和浓度已知的维生素E，第二标准工作液中含有浓度已知的25-羟基维生素D2、浓度已知的25-羟基维生素D3、浓度已知的维生素K1和浓度已知的维生素K2；将该离心管在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混匀1min-2min后，移取上清液以得到标准溶液。 10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述得到标准溶液之前，进一步包括：精确称取10mg的维生素A的标准品，并置于10mL容量瓶中，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第一标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；选购25-羟基维生素D2的浓度在10μg/mL-1000μg/mL之间的第三标准储备液；选购25-羟基维生素D3的浓度在10μg/mL-1000μg/mL之间的第四标准储备液；精确称取25mg的维生素E的标准品，并置于5mL容量瓶中，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第二标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；精确称取10mg的维生素K1的标准品，并置于10mL容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到第五标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；精确称取10mg的维生素K2的标准品，并置于10mL容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到第六标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；临用前测定所述第一标准储备液中维生素A的浓度、所述第二标准储备液中维生素E的浓度，然后根据所述第一标准储备液中维生素A的浓度和所述第二标准储备液中维生素E的浓度，取一定量的所述第一标准储备液于一定体积的容量瓶中，用无水乙醇进行稀释并定容，以得到第一校正工作液，并取一定量的所述第二标准储备液于一定体积的容量瓶中，用无水乙醇进行稀释并定容，以得到第二校正工作液，再取一定量的所述第一校正工作液和一定量的所述第二校正工作液于一定体积的容量瓶中，用90％甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述第一标准工作液，且所述第一标准工作液中维生素A的浓度介于0.03125μg/mL-4.0μg/mL之间，维生素E的浓度介于0.625μg/mL-80μg/mL之间；取一定量的所述第三标准储备液、一定量的所述第四标准储备液、一定量的所述第五标准储备液、一定量的所述第六标准储备液置于一定体积的容量瓶中，用90％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述第二标准工作液，且所述第二标准工作液中25-羟基维生素D2的浓度介于3.9ng/mL-500ng/mL之间，25-羟基维生素D3的浓度介于12.5ng/mL-1600ng/mL之间，维生素K1的浓度介于0.5ng/mL-1000ng/mL之间，维生素K2的浓度介于0.5ng/mL-1000ng/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月；取10mg维生素A的内标物，该内标物为维生素A的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第一内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；选购25-羟基维生素D2的内标物的浓度为100μg/mL为第三内标储备液，该内标物为25-羟基维生素D2的同位素内标物，且浓度为100μg/mL，并在-80℃下保存，有效期为1年；取0.5mg25-羟基维生素D3的内标物，该内标物为25-羟基维生素D3的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第四内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；取1mg维生素E的内标物，该内标物为维生素E的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第二内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；取1mg维生素K1的内标物，该内标物为维生素K1的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第五内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；取0.25mg维生素K2的内标物，该内标物为维生素K2的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第六内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；取一定量的所述第一内标储备液、一定量的所述第二内标储备液、一定量的所述第三内标储备液、一定量的所述第四内标储备液、一定量的所述第五内标储备液、一定量的所述第六内标储备液置于一定体积的容量瓶中，用90％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述混合内标工作液，且所述混合内标工作液中维生素A的同位素的浓度为4μg/mL，25-羟基维生素D2的同位素的浓度为100ng/mL，25-羟基维生素D3的同位素的浓度为350ng/mL，维生素E的同位素的浓度为33μg/mL，维生素K1的同位素的浓度为30ng/mL，维生素K2的同位素的浓度为30ng/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。
所属类别：	发明专利