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原文传递一种检测牛、羊口蹄疫病毒O型抗体的B-ELISA试剂盒及制备方法

专利名称：	一种检测牛、羊口蹄疫病毒O型抗体的B-ELISA试剂盒及制备方法
摘要：	本发明涉及一种检测牛、羊口蹄疫病毒O型抗体的试剂盒，包括分别放置的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板和口蹄疫病毒O型VP1蛋白特异性单克隆抗体。本发明还提供一种上述试剂盒的制备方法。本发明试剂盒采用阻断ELISA的方式检测牛、羊血清中口蹄疫病毒O型抗体(仅适用于检测牛、羊)，可适用于牛、羊口蹄疫病毒O型血清抗体的快速诊断、检测和流行病学调查，可以在同行业界内进行推广。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	云南;53
申请人：	艾军
发明人：	韩佃刚;赵胜兰;杨园渊;起绍琼;张志诚;段博芳;艾军;周晓黎;祝贺;尹尚莲;刘敏;李佳超
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910557109.8
公开号：	CN110187105A
代理机构：	昆明盛鼎宏图知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	王辉
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	650000 云南省昆明市滇池路429号
主权项：	1.一种检测口蹄疫病毒O型抗体的试剂盒，其特征在于，包括分别放置的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板和口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体。 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板为使用昆虫杆状病毒表达的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板；所述的口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体为使用纯化的灭活口蹄疫病毒O型抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得杂交瘤细胞株2D8，取杂交瘤细胞，注射降植烷处理的小鼠，取腹水，利用ProteinG柱纯化的2D8单抗。 3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括分别放置的强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP标记羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。 4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含质量分数0.05％～0.1％Tween-20的0.01mol/LpH 7.4 PBST；稀释液为含质量分数0.05％～3％BSA、0.05％～0.1％Tween-20pH 7.4的PBS；底物液为可溶性TMB；终止液为1mol/L H2SO4溶液。 5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒各组成部分的体积或数量如下： 6.一种口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：1)利用pFastBacHTA载体，扩增口蹄疫病毒O型株VP1基因； 2)通过PCR和限制性内切酶EcoRI和KpnI，构建得口蹄疫病毒O型pFastBacHTA-FMDV O型VP1质粒，该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞； 3)经抗生素和PCR筛选，获得转座的杆粒Bacmid-FMDV O型VP1； 4)转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，再感染细胞，反复冻融，8000rpm离心，收获上清； 5)35000rpm超速离心，按超速离心前后体积300:1，用PBS稀释，获得口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原。 7.根据权利要求6所述的一种口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原制备方法，其特征在于，步骤2、3中的PCR参数为，上游引物TTT GAA TTC ACC ACC TCC CCG GGC G，下游引物TTG GTACCT TCA AAA GCT GTT TTG CGG GT，扩增条件95℃，3min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；4℃保存。 8.使用权利要求6所述的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原制备包被板的方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤： 1)将口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原按照1:500～1:1000比列，用pH9.0-10.0碳酸盐缓冲液稀释； 2)每孔100ul加入高吸附可拆酶标板，4℃放置18～24h； 3)洗板3次，用含质量分数0.5％～1％BSA的PBS缓冲液封闭1h； 4)PBST洗液洗板，37℃干燥箱干燥1h～3h制得。 9.一种抗口蹄疫病毒O型VP1蛋白的单克隆抗体制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤： 1)用纯化的口蹄疫O型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂乳化和弗氏不完全佐剂乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次； 2)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞； 3)用间接ELISA方法检测分泌抗FMDV O型VP1蛋白的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆； 4)获得能稳定传代并分泌抗FMDV O型VP1蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞2D8株； 5)培养的2D8杂交瘤细胞株，注射降植烷处理的小鼠腹腔，取腹水，利用ProteinG柱纯化获得2D8单抗。
所属类别：	发明专利