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原文传递一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法

专利名称：	一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法
摘要：	本发明涉及一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法，包括如下步骤：（1）细菌培养，所述的细菌为鸡白痢沙门菌S06004和S06004ΔspiC；（2）鸡的免疫及采样；（3）靶细胞—巨噬细胞的制备；（4）效应细胞—鸡脾脏CD8+T细胞的制备：包括鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备步骤和磁珠分选鸡脾脏CD8+T细胞的步骤；（5）CTL特异性杀伤巨噬细胞。相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明贴壁获得的巨噬细胞（靶细胞）纯度较高，且鸡脾脏CD8+T细胞分选效果明显，分离时间短；以沙门菌宿主细胞—巨噬细胞作为靶细胞，可更精确反映宿主对沙门菌的清除能力；将流式细胞术用于鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用，可在单细胞水平检测鸡脾脏CD8+T细胞的CTL效应。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	扬州大学
发明人：	焦新安;唐娟;潘志明;胡茂志;康喜龙;孟闯;顾丹;王晶
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910405117.0
公开号：	CN110196219A
代理机构：	南京纵横知识产权代理有限公司
代理人：	薛海霞;董建林
分类号：	G01N15/14(2006.01);G;G01;G01N;G01N15
申请人地址：	225009 江苏省扬州市大学南路88号
主权项：	1.一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法，其特征在于，可以单细胞水平检测鸡CD8+T细胞的特异性杀伤作用，包括如下步骤：（1）细菌培养，所述的细菌为鸡白痢沙门菌S06004和S06004ΔspiC；（2）鸡的免疫及采样；（3）靶细胞—巨噬细胞的制备，以分离的原代巨噬细胞作为靶细胞，更接近机体自然状态，提供更准确的结果；（4）效应细胞—鸡脾脏CD8+T细胞的制备：包括鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备步骤和磁珠分选鸡脾脏CD8+T细胞的步骤；（5）CTL特异性杀伤巨噬细胞，通过流式细胞术检测细胞凋亡，可以单细胞水平检测特异性杀伤能力。 2.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体为：挑取鸡白痢沙门菌S06004，S06004ΔspiC单菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期，调整细菌浓度。 3.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法，其特征在于，所述的步骤（2）具体为：将3日龄雏鸡随机分成2组，分别肌肉注射免疫PBS和S06004ΔspiC。 4.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法，其特征在于，所述的步骤（3）具体为：用淋巴细胞分离液分离鸡外周血淋巴细胞，贴壁培养获得巨噬细胞，取部分贴壁巨噬细胞用鼠抗鸡巨噬细胞抗体标记，进行纯度测定，剩余巨噬细胞接种于96孔板，培养过夜。 5.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法，其特征在于，鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备步骤具体为：将鸡脾脏研磨过滤获得淋巴细胞悬液，低速离心2次去除部分红细胞，经淋巴细胞分离液分离获得鸡淋巴细胞。 6.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法，其特征在于，磁珠分选鸡脾脏CD8+T细胞步骤具体为：用CD8α-APC和抗鼠IgG的磁珠分别作为一抗、二抗标记鸡淋巴细胞，通过LS柱进行分离获得鸡脾脏CD8+T细胞，取部分鸡脾脏CD8+T细胞进行纯度测定。 7.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法，其特征在于，步骤（5）具体为：将细菌S06004加到过夜培养的巨噬细胞中，离心、培养1h，加入含100 µg/mL庆大霉素的培养基培养1 h杀死巨噬细胞外的细菌；更换含10 µg/mL庆大霉素的培养基抑制胞外细菌的增殖、继续培养5 h，随后加入脾脏CD8+T细胞，共同培养24h，收取细胞，检测靶细胞的凋亡情况，评价鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用。 8.如权利要求1-7所述基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+T细胞特异性杀伤作用的方法可用于沙门菌疫苗免疫效果及细胞免疫应答的评价。
所属类别：	发明专利