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原文传递一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法

专利名称：	一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法
摘要：	一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，包括以下步骤：步骤1，接种并培养细胞；步骤2，收集细胞并染色：采用CD2‑APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群，随后采用Annexin V‑FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色；步骤3，流式上机检测。本发明使用Annexin V‑FITC/SYTOX Green双染，采用相同检测通道将凋亡细胞和坏死细胞全部标记出来，显著降低了对NK杀伤后肿瘤细胞各种不同状态(早期凋亡、中晚期凋亡或坏死细胞)的漏检。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	陕西;61
申请人：	西安交通大学
发明人：	胡劲松;张丹;雷莉;王爱英
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910420306.5
公开号：	CN110231275A
代理机构：	西安通大专利代理有限责任公司
代理人：	李红霖
分类号：	G01N15/14(2006.01);G;G01;G01N;G01N15
申请人地址：	710049 陕西省西安市咸宁西路28号
主权项：	1.一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，接种并培养细胞；步骤2，收集细胞并染色：采用CD2-APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群，随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色；步骤3，流式上机检测。 2.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，步骤1具体包括：接种KHYG-1、K562细胞(或其他肿瘤细胞作为靶细胞)并培养，实验前1-2天给细胞换液，调整细胞至对数生长期的最佳状态；KHYG-1细胞培养于含IL-2的细胞培养基中。 3.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，步骤2包括以下步骤： 1)NK细胞为效应细胞，肿瘤细胞为靶细胞，1500rpm离心NK细胞和肿瘤细胞5分钟，重悬并分别计数，调整细胞密度为0.5х106/ml； 2)接种细胞至24孔板(或96孔V型板，细胞培养体积减少至1/10)；设置不同效应细胞与靶细胞比例，E:T ratio；取1ml K562细胞加入对照孔，取1ml KHYG-1细胞和1ml K562细胞混合后加入实验孔； 3)继续培养4小时； 4)收集2孔细胞至流式管，于1500rpm离心细胞5分钟，弃掉上清，用4℃的PBS缓冲液洗涤1-2次； 5)每管加入4℃的100μl FACS staining buffer，再加入5μl CD2-APC荧光染料，冰浴避光静置30分钟； 6)用4℃的PBS缓冲剂离心洗涤细胞1-2次后，每管加入4℃的100μl Annexin V-FITCbinding buffer，再加入5μl Annexin V-FITC荧光染料和1μl SYTOX Green荧光染料，冰浴避光静置15分钟； 7)流式上机检测前，每管补加300μl Annexin V-FITC binding buffer。 4.根据权利要求3所述的一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，PBS缓冲液含0.5％BSA和0.1％叠氮化钠；SYTOX Green荧光染料的浓度为1mg/ml。 5.根据权利要求3所述的一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，步骤3包括以下步骤： 1)在FSC/SSC散点图中，设门圈定包括效应细胞和靶细胞的全部细胞； 2)在APC/SSC散点图中，将Step 1圈定的细胞分为APC+和APC-细胞，APC+为表达CD2的KHYG-1(NK)细胞，APC-为CD2表达阴性的K562细胞(肿瘤靶细胞)； 3)在FITC/Count直方图中，分析Step 2中APC-细胞的FITC通道荧光强度，计算出早期凋亡、中晚期凋亡和坏死的K562细胞总比例。
所属类别：	发明专利