详情

原文传递基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法

专利名称：	基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法
摘要：	基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，包括以下步骤：探针1的制备：制备不同种类的荧光编码微球；分别用链霉亲和素标记荧光编码微球；用生物素标记捕获抗体；将链霉亲和素标记的编码微球与生物素标记的捕获抗体偶联；探针2的制备：用荧光染料标记检测抗体；荧光共振能量转移体系进行多组分生物标志物检测的反应体系为：在上述反应体系中，加入样本中存在肿瘤标志物时，探针1与探针2结合到一起，形成荧光共振能量转移体系；通过将检测的编码微球在探针2最大发射波长的荧光强度带入工作曲线，即可得出不同种类肿瘤标志物的浓度。该方法灵敏、快速、高通量、价格低。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	长春国科医工科技发展有限公司
发明人：	高玉舟;乔善鹏;刘珍妮;崔继承;庄伟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-13T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-24T00:00:00+0800
申请号：	CN201910393710.8
公开号：	CN110275023A
代理机构：	吉林省长春市新时代专利商标代理有限公司
代理人：	唐盼
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	130000 吉林省长春市仙台大街2686号
主权项：	1.基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：一、探针1的制备 A、制备不同种类的荧光编码微球，所述荧光编码微球的种类与待检测肿瘤标志物的数量相对应； B、分别用链霉亲和素标记步骤A制备的荧光编码微球； C、用生物素标记捕获抗体，所述捕获抗体为待检测的肿瘤标志物的捕获抗体； D、将步骤B链霉亲和素标记的编码微球与步骤C生物素标记的捕获抗体偶联，不同肿瘤标志物与不同种类的荧光编码微球相结合，通过荧光编码微球的荧光强度识别肿瘤标志物；二、探针2的制备用荧光染料标记检测抗体，所述检测抗体与捕获抗体为配对抗体；三、荧光共振能量转移体系进行多组分生物标志物检测的反应体系为：在上述反应体系中，当加入样本或标准品中存在肿瘤标志物时，就会被所对应的荧光编码微球捕获，探针1与探针2结合到一起，形成荧光共振能量转移体系；此时，通过编码波长的荧光强度判定编码微球，决定被测肿瘤标志物的种类；通过将检测的编码微球在探针2最大发射波长的荧光强度带入工作曲线，即可得出不同种类肿瘤标志物的浓度；四、工作曲线先将浓度为0.05-30ng/ml的不同浓度的肿瘤标志物标准品样本分别与缓冲液、探针1混合后，置于孵箱中恒温避光反应，再加入探针2充分混匀，置于孵箱中恒温避光反应，加终止液充分混匀，将该体系置于流式细胞仪上检测探针2最大发射波长的荧光强度，通过编码波长的荧光强度判定编码微球，决定被测肿瘤标志物的种类；记录流式细胞仪上反应体系在探针2最大发射波长的荧光强度，存在肿瘤标志物时F，不存在肿瘤标志物时F0，以(F-F0)对不同肿瘤标志物浓度分别绘制标准曲线，拟合方程为浓度和荧光强度的取常用对数后的值；五、待测样本检测通过荧光共振能量转移体系检测待测样本的荧光信号，将待测样本的荧光信号值带入标准曲线，得出待测样本中不同种类肿瘤标志物的含量。 2.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，步骤A中制备荧光编码微球的方法为：取羧基化聚苯乙烯微球，用溶胀液清洗羧基化聚苯乙烯微球，将清洗后的羧基化聚苯乙烯微球平均分成几份，分别向编码微球中加入发射波长565nm的量子点和发射波长605nm的量子点进行编码，加入发射波长645nm的量子点为荧光染料荧光共振能量转移提供能量，加入量子点后的编码微球分别在溶胀体系中室温孵育，反应完成后离心处理，得到量子点编码微球，将得到的量子点编码微球清洗、离心、真空干燥，即得到不同量子点编码的荧光微球。 3.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，步骤B中链霉亲和素标记编码微球的方法为：取步骤A不同量子点编码后的羧基化聚苯乙烯荧光微球，溶解在吗啉乙磺酸缓冲液中，同时加入链霉亲和素，碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基丁二酰亚胺酯，混合后反应，之后离心，清洗，即可得到链霉亲和素修饰的荧光编码微球。 4.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，步骤C中用生物素标记捕获抗体的方法为：用无水DMF溶解活化的生物素，加入捕获抗体后室温孵育，用PBS溶液对生物素标记的捕获抗体过夜透析，除去未反应的生物素，即可得到生物素标记的捕获抗体。 5.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，步骤二中荧光染料标记检测抗体1的方法为：用PBS缓冲液充分溶解荧光素APC，平分为4份，分别加入CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE检测抗体1，同时均加入碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基丁二酰亚胺酯，室温孵育，通过纯化柱进行洗脱分离，得到APC标记的检测抗体，即探针2。 6.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤三中的终止液为含0.1％SDS的PBS缓冲液。 7.权利要求2所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤A中的编码微球为四种，记为编码微球1、2、3、4；编码微球1中加入5μL发射波长565nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；编码微球2中加入3μL发射波长565nm的量子点、7μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；编码微球3中加入7μL发射波长565nm的量子点、3μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；编码微球4中加入5μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；步骤C中的捕获抗体为CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE的捕获抗体1；编码微球1、2、3、4分别与CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE的捕获抗体偶联，得探针1。 8.权利要求2所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，溶胀液为5％氯仿和95％正丁醇的混合液。 9.权利要求2所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述量子点为CdSe量子点。
所属类别：	发明专利