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原文传递一种以平面色谱成分微阵列高通量筛选复杂成分中生物活性成分的方法及其应用

专利名称：	一种以平面色谱成分微阵列高通量筛选复杂成分中生物活性成分的方法及其应用
摘要：	本发明属于活性成分筛选领域，涉及一种“以平面色谱成分微阵列”高通量筛选复杂成分中生物活性成分的方法。本发明将整体反映复杂成分分子多样性及其差异特征的平面色谱制备成“平面色谱成分微阵列”样本，以该样本开展生物活性试验、聚焦到显著生物活性阵列单元开展质谱分析；以具有显著生物活性阵列单元区域上的生物活性强度与相应阵列单元的生物质谱准分子离子峰强度之间的依赖关系及它们的色谱行为耦合度为指征，从成分复杂、含量悬殊的复杂成分中解析生物活性成分。本发明无须预先对化学成分逐一分离纯化，无须全面的分析检测，不依赖分子多样性化合物库、样本可平行扩增、兼容性好、高通量、数字化，极大提高筛选效率，减少工作量和成本。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广东医科大学
发明人：	邓亦峰;林振鹏
专利状态：	有效
申请日期：	2018-02-14T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201810151546.5
公开号：	CN110161171A
代理机构：	北京市万慧达律师事务所
代理人：	谢敏楠;梁顺珍
分类号：	G01N30/90(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	524003 广东省湛江市霞山区文明东路2号
主权项：	1.一种筛选生物活性成分的方法，其特征在于：包含以下步骤： S1.构建反映和记载待筛选样本化学成分差异特征及其色谱行为、且色谱图展距和通道宽度与微孔板阵列格式一致的平面色谱指纹图谱； S2.将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离、定位洗脱到微孔板的微孔池中，制备成平面色谱成分微阵列样本； S3.将平面色谱成分特性以阵列方式进行数字化表述； S4.将平面色谱成分微阵列样本进行生物活性检测，构建生物活性热点图，选取活性热点阵列单元； S5.针对活性热点阵列单元及其毗邻区阵列单元开展质谱分析； S6.对活性热点阵列单元及其毗邻区阵列单元的生物活性强度和质谱准分子离子峰强度进行关联、耦合、归一化分析，遴选出生物活性成分； S7.将平面色谱图、生物活性热点图和活性化合物之间的对应关系量化可比地表达出来，构建“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱。 2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，重复步骤S1～S4，优化平面色谱成分的试验浓度区间，制备具有代表性的调制样品，优化平面色谱的二维色谱溶剂系统，制备优化后的平面色谱成分微阵列样本。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述的待筛选样本为复杂成分提取物；优选地，所述复杂成分提取物为天然产物；更优选地，所述的天然产物选自陆生动植物、海洋生物或微生物提取物；或者优选地，所述的待筛选样品选自中药复方提取物、人工合成产物或生物工程产物；优选地，所述的提取物的制备方法为：分别采用Snyder提出的8类溶剂中每类各选至少一种溶剂进行超声提取，合并提取液后，再除溶剂得到的复杂成分提取物；更优选地，所述的8类溶剂中包含石油醚、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、苯和水；优选地，所述的平面色谱选自无支撑基体的平面色谱和/或有支撑基体的平面色谱；更优选地，所述的无支撑基体的平面色谱选自凝胶电泳、聚合物膜电泳、聚合物膜薄层色谱或电泳条带转膜的聚合物膜；更优选地，所述的有支撑基体的平面色谱选自玻璃板基体的制备型硅胶薄层色谱板或铝基薄层色谱硅胶板；还更优选地，所述的平面色谱选自铝基薄层色谱硅胶板；优选地，步骤S1中，还包括平面色谱的分离度和浓度分布的考察；更优选地，采用紫外光下观察、碘熏和硫酸-香草醛试剂显色考察平面色谱的分离度和浓度分布。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述的微孔板为方口微孔板；更优选地，所述的方口微孔板为384孔方口微孔板，其阵列格式为4.5mm见方的横24×纵16阵列；同时，所述的平面色谱的展距和通道宽度为4.5mm的倍数，包含展距9.0cm×通道7.2cm的一维平面色谱和展距7.2cm×通道7.2cm的二维平面色谱。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，采用与微孔板阵列格式对应的网格接口板对色谱薄层划分、剥离；优选地，所述的网格接口板材料为硬质、有韧性的金属材料；更优选地，所述的网格接口板的材质为钴铬合金或不锈钢；优选地，所述的网格接口板的每个网格内空为四棱台；更优选地，所述的网格接口板为4.5mm×4.5mm方格的横24×纵16阵列格式，网格边框纵截面为高2.5mm的等腰梯形，等腰梯形的下底边宽度与384方口微孔板的微孔池池边厚度相同，为0.68-0.72mm；等腰梯形的上底边宽度≤0.15mm；优选地，所述的网格接口板通过3D打印制备；优选地，步骤S2中，定位洗脱采用与微孔板对应的微孔过滤板；更优选地，所述的微孔过滤板为384方口微孔过滤板；还更优选地，所述的384方口微孔过滤板的型号为Pall No.5072；优选地，步骤S2中，定位洗脱的步骤为：把剥离并定位于网格接口板中的色谱层推入微孔过滤板的微孔池中，然后将微孔过滤板对齐接受洗脱液的微孔板，采用溶剂把色谱固定相上的色谱成分定位洗脱到微孔板中相应的微孔池中，得到平面色谱成分微阵列样本。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述的生物活性检测选自细胞生存率检测、免疫反应、配体反应、生物活性探针检测、细菌培养和斑马鱼药效模型中的一种或几种；优选地，步骤S4中，所述的活性热点阵列单元指经过生物活性检测，具有显著的生物活性的阵列单元；优选地，步骤S5中，所述的质谱分析方法选自可得到与样品各化学组分分子量有对应关系的准分子离子峰的带有软电离离子源的质谱分析；更优选地，所述的软电离离子源选自液相色谱-质谱联用中的电喷雾电离、大气压化学电离、大气压光电离，基质辅助激光解吸电离，或为气相色谱-质谱联用中的化学电离；尤其优选地，所述的软电离离子源选自电喷雾电离。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中，通过以平面色谱微阵列样本中生物活性强度与质谱准分子离子峰强度相互依赖、色谱行为耦合的化合物分子作为药效物质基础的筛选指征，并对阵列单元中归属于相同分子的生物活性归一化作为该分子的活性贡献度纳入遴选考量，从庞大而复杂的提取物中高通量筛选生物活性成分；优选地，步骤S6，其具体操作如下：以活性阵列单元及其毗连区域阵列单元的生物活性强度阵列为变量1；以相应区域阵列单元共存的各主要准离子峰的强度为变量2；对变量1和变量2进行阵列的相关性分析，计算出各准分子离子峰与生物活性的相关系数；根据相关系数的大小筛选出活性成分；优选地，以相关系数排序遴选准离子峰对应的化合物作为生物活性物质，相关性系数越大、相互差异越显著，可信度越高；当相关系数为负数时，该准离子峰对应的化合物不考虑为活性物质；优选地，阵列的相关性分析采用计算机阵列相关性分析软件进行计算；更优选地，采用Excel的Correl函数进行阵列相关性分析。 8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，优化平面色谱指纹图的试验浓度区间的步骤为：参照步骤S1和S2，在阶梯浓度点样，制备成一维平面色谱成分微阵列样本，并在该微阵列开展生物活性检测，构建生物活性分布图，根据生物活性热度与其对应的试液浓度，筛选出显著反映各阵列单元生物活性的试液浓度区间。 9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，调制样品的制备步骤如下：参照步骤S1和S2，在制备平面色谱板上高浓度平行点样，制备成横20×纵16阵列格式的平面色谱成分微阵列样本，依据优选出的各阵列单元生物活性的试液浓度区间，在微阵列样本上取样，在横20阵列范围里调整纵16个阵列单元色谱成分的比例，得到调制样品。 10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S7中，以平面色谱成分微阵列样本的阵列格式为X、Y二维坐标，映射到对应的平面色谱指纹图阵列单元区域，在阵列单元上建立Y轴标示该阵列单元的活性值和活性分子标签，构建起“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱；优选地，所述的活性分子标签为结构式、分子式或名称中的至少一种。
所属类别：	发明专利