详情

原文传递同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法

专利名称：	同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法
摘要：	本发明公开了一种同时检测乳制品中β‑乳球蛋白和a‑乳白蛋白两种过敏原的方法，属于生物免疫分析领域。该方法将β‑乳球蛋白和α‑乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β‑乳球蛋白抗体和α‑乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体为二抗，四甲基联苯胺(TMB)作为底物显色液，然后建立灵敏、特异性强的间接竞争ELISA，最后对结果进行数据分析。该方法不仅具有ELISA法的灵敏度高、特异性强、重复性好特点，而且最大优势在于省时省力，一次可包被两种抗原，并同时检测两种抗原性，突破以往检测单一过敏原的模式，可用于同时检测乳制品中过敏原β‑乳球蛋白和a‑乳白蛋白的总含量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河北;13
申请人：	河北科技大学
发明人：	李书国;王佳蕊;郝雅茹;齐慧丽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910568538.5
公开号：	CN110208546A
代理机构：	北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	邢文月
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	050000 河北省石家庄市裕华区裕翔街26号
主权项：	1.同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，将β-乳球蛋白和α-乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β-乳球蛋白抗体和α-乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，采用间接竞争酶联免疫法同时检测两种过敏原的抗原性，其中，抗原包被的质量浓度为0.2～10.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:4000～16000。 2.根据权利要求1所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，抗原包被的质量浓度为0.5～5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:8000～12000。 3.根据权利要求2所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，抗原包被的质量浓度为5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为12000。 4.根据权利要求1所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:5000～1:40000。 5.根据权利要求4所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:10000。 6.根据权利要求1-5任一项所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，包括以下步骤：标准曲线的建立、样品吸光值测定、以及根据标准曲线计算得到牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度。 7.根据权利要求6所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，标准曲线的建立方法为： (1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h； (2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST震荡洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液； (3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液； (4)竞争结合：用PBS稀释β-乳球蛋白和a-乳白蛋白混合标准品，做0.1ng/ml～1000ng/ml梯度稀释，并与所述的稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液； (5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液； (6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min； (7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应； (8)吸光值测定：采用双波长测定各孔的OD450和OD620值，实际OD＝OD450-OD620； (9)标准曲线的绘制：将β-乳球蛋白和a-乳白蛋白混合标品各浓度对应的OD值转换成B/B0的％值，抗原浓度为0时的OD值为B0，其余浓度对应的OD值为B；以B/B0％值为纵坐标，以相对应的抗原浓度的对数为横坐标，制作标准曲线； (10)线性回归线段：选择标准曲线呈明显相关的区段，计算各标准点的Logit((B/B0)％)，再做对应的抗原浓度的对数的Logit((B/B0％)回归分析。 8.根据权利要求6所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，样品吸光值测定的方法为： (1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h； (2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液； (3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液； (4)抗原抗体结合：将待测样品分别处理为所述稀释度的待测液，并与所述稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液； (5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液； (6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min； (7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应； (8)吸光值测定：采用双波长测定各孔的OD450和OD620值，实际OD＝OD450-OD620。 9.根据权利要求8所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，所述待测样品为牛乳、奶粉、乳清蛋白粉和水解乳清蛋白粉中的一种或多种。 10.根据权利要求9所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，待测样品的预处理方法为：对于液体样品： (1)脱脂：将待测样品用4层消毒纱布过滤，去除固体杂质，随后用4℃冷冻离心机2500g转速，10min脱脂，得到脱脂乳； (2)去除酪蛋白：采用等电点沉淀法，将脱脂乳用1mol/L盐酸调其pH至4.6，10min中后使用4℃冷冻离心机2500g转速，15min收集上清液，得到乳清； (3)去除乳糖及矿物质：将得到的乳清在70℃中预热30min，采用超滤技术截留乳糖以及矿物质成分，得到脱除乳糖的乳清，4℃以下保存待测。对于固体样品：取1g样品于50mlPBS溶液中，剧烈震荡5min混匀备用，待测时需稀释到一定倍数检测。
所属类别：	发明专利