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原文传递液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法

专利名称：	液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法
摘要：	本发明提供液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法。该方法包括：配制不同浓度的游离维生素D标准品溶液；向标准品溶液中加入稳定同位素内标混匀，然后用正己烷提取，上清液用氮气吹干，加入PTAD进行衍生化后氮气吹干，加入复溶液，进行液相色谱串联质谱检测；根据标准品溶液的浓度以及检测到的信号强度绘制标准曲线；用待测样本替代步骤B中的标准品溶液进行检测；根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中游离维生素D的浓度，从而实现对样品中游离维生素D的定量检测。本发明成功建立了液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法，该方法可快速、特异地检测样品(特别是血清)中游离维生素D的含量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国医学科学院北京协和医院
发明人：	王丹晨;禹松林;邱玲
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910502020.1
公开号：	CN110174477A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;黄爽
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	100730 北京市东城区王府井帅府园1号
主权项：	1.液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法，其特征在于，包括以下步骤： A、配制不同浓度的游离维生素D标准品溶液； B、对样品进行前处理：向标准品溶液中加入稳定同位素内标混匀，然后用正己烷提取，上清液用氮气吹干，加入PTAD进行衍生化，然后氮气吹干，加入复溶液，进行液相色谱串联质谱检测； C、根据标准品溶液的浓度以及检测到的信号强度绘制标准曲线； D、用待测样本替代步骤B中的标准品溶液，采用相同方法进行检测； E、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中游离维生素D的浓度，从而实现对样品中游离维生素D的定量检测；其中，所述样品包括血清、血浆。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D具体如下：用HEPES缓冲液调节血清pH至7.4±0.3，涡旋混匀，37℃水浴30min，取500μl混合物加入超滤管中，37℃，14000g离心30min；取滤液，加入500μl生理盐水洗涤，14000g离心30min，取滤液；超滤膜用生理盐水洗3遍，加入500μl无水甲醇洗涤超滤膜，取滤液；将上述滤液合并，取1ml滤液，加入500μl50-2000pg/mL同位素内标25-羟基维生素D3-d3溶液混匀，然后加入200μl水及2mL正己烷提取，涡旋、离心、取上清，氮气吹干，加入0.01-1mg/mL PTAD溶液50μl，室温放置1h，然后氮气吹干，加入100μl复溶液，准备上机检测；其中，所述复溶液为含有0.01％-1％v/v甲酸的甲醇溶液与水按1-10:1体积比混合而成的混合液，优选为含有0.1％v/v甲酸的甲醇溶液与水按1:1体积比混合而成的混合液。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所用液相色谱柱为AscentisExpress F5 Column；进行色谱检测所用流动相如下：流动相A：含有0.01％-0.5％v/v甲酸的甲醇溶液，优选为含有0.1％v/v甲酸的甲醇溶液；流动相B：含有0.01％-0.5％v/v甲酸的水溶液，优选为含有0.1％v/v甲酸的水溶液。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，液相色谱检测条件如下：柱温为40℃，进样量为50μl；按以下程序进行梯度洗脱：。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中进行质谱检测，采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；离子源温度为300-600℃；GS1：20-100；GS2：20-100；具体监测的离子对以及碰撞能量、去簇电压如下：。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，质谱检测的离子源温度为400℃，GS1：55，GS2：75。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，游离维生素D在质谱中所产生的检测信号的母离子具有558.4的质荷比；游离维生素D的子离子包含质荷比为298.2、290.4的子离子。 8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，游离维生素D的线性检测范围为3.9-500ng/ml，最低检出限为1.9ng/ml。 9.用于液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括游离维生素D标准品溶液、稳定同位素内标溶液、HEPES缓冲液、正己烷、甲醇、复溶液中的至少一种；其中，所述稳定同位素内标溶液为50-2000pg/mL25-羟基维生素D3-d3溶液；所述复溶液为含有0.01％-1％v/v甲酸的甲醇溶液与水按1-10:1体积比混合而成的混合液。
所属类别：	发明专利