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原文传递一种可视化检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法

专利名称：	一种可视化检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法
摘要：	本发明公开了一种基于二氧化钛纳米矩阵‑石墨相氮化碳纳米片（TiO2‑C3N4）异质结光电材料的合成，并结合G‑四联体信号放大策略实现可视化和特异性灵敏检测端粒酶。首先利用水热法合成TiO2‑C3N4异质结，有效地促进载流子分离与空穴传输，产生的光电流密度分别比普通TiO2和原始石墨相氮化碳纳米片（g‑C3N4 NSs）显著提高12倍和35倍。同时引入了催化发夹组装（CHA）的无酶信号放大策略，在引入端粒酶后，端粒酶延伸产物特异性地触发环状CHA并导致G‑四链体/血红素DNA酶的连续形成，另外结合3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺（TMB）的氧化颜色变化和光电流的输出，实现了方便和精准的信号读出，表现出优异的灵敏度，有望在癌症诊断和治疗中提供巨大的潜在应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	于京华;殷雪梅;李丽;葛慎光
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910587992.5
公开号：	CN110231386A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	赵凤
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	250022 山东省济南市南辛庄西路336号
主权项：	1.一种可视化检测端粒酶的光电化学生物传感器的构建方法，其特征是包括以下步骤： 1.1 将氟掺杂氧化锡（FTO）导电玻璃裁剪成1 cm×5 cm尺寸，依次放入丙酮、无水乙醇、超纯水中超声处理10-30 min，然后在60-80 ℃烘箱中干燥40-60 min，随后保存以备用； 1.2 以FTO导电玻璃作为基底，合成负载葡萄糖氧化酶的二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片异质结光电材料（GOx-TiO2-C3N4）修饰FTO导电玻璃，具体操作步骤如下：（1）合成石墨相氮化碳纳米片（g-C3N4 NSs）：首先，称量1-5 g三聚氰胺粉末置于带有盖子的瓷坩埚中，在通风状态下于600 ℃下加热2-3 h，其中加热和冷却过程的速率均为3 ℃/min，合成黄色大块石墨相氮化碳（g-C3N4）；随后，将g-C3N4研磨至超细粉末，称取10-200 mg分散在10-200 mL超纯水中，超声15-20 h，超声后得到的悬浮液以8000 r/min的速度离心，以除去剩余未剥离的g-C3N4；最后，在60 ℃真空条件下收集并浓缩上清液，得到的乳状悬浮液即为g-C3N4 NSs；（2）制备二氧化钛纳米矩阵-石墨相氮化碳纳米片（TiO2-C3N4）异质结：5-20 mL盐酸（12 M）加入5-20 mL超纯水中，室温搅拌10-30 min，加入0.2-5 mL钛酸四正丁酯溶液和1-5 mL g-C3N4 NSs溶液，继续搅拌30-60 min得到混合溶液；将步骤1.1中的干燥FTO导电玻璃以导电面向下的方式放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将上述混合溶液转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的150-200 ℃烘箱内恒温反应30-300 min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出FTO，用超纯水彻底清洗3次，然后放入真空干燥箱中60-80 ℃干燥8-10 h；（3）将5-10 mg·mL-1的葡萄糖氧化酶（GOx）溶液（0.01 M PBS中，pH7.4，20-50μL）滴加到TiO2-C3N4异质结修饰的FTO上，室温下干燥，重复三次后放入冰箱中以备后续使用； 1.3 进行细胞培养和端粒酶延伸，形成端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶：（1）细胞培养和端粒酶提取：将人宫颈癌（HeLa）细胞加到补充有10-15％（体积比）热灭活的胎牛血清和1-5％（体积比）青霉素-链霉素溶液的杜尔贝克改良的老鹰培养基中，然后于37 ℃下在含有5-10％ CO2的潮湿气氛中培养；对于端粒酶提取，需在指数生长期收集细胞，将1×106个细胞分散在1.5 mL EP管中，用冷的PBS （0.1M，pH7.4）洗涤两次，并重悬于200-300 μL冷的CHAPS裂解缓冲液中；随后将细胞混合物在冰上孵育30-60 min，并在4 ℃下以14000 rpm的转速离心20-30 min，小心收集上清液并转移至新鲜的1.5 mL EP管中，然后在-80 ℃下冷冻以供进一步使用；其中所有的管和尖端都不含核糖核酸酶；（2）端粒酶延伸：将从一定数量的细胞中提取的端粒酶在1×CHAPS裂解缓冲液中连续稀释，然后将2-5 μL端粒酶提取物与端粒酶延伸反应缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5 mM MgCl2，63 mM KCl，0.05％Tween 20，1mM N,N,N',N'-四乙酸，1 mM 碱磷酸去氧核苷酸，0.2 μM端粒酶引物和0.4 UμL-1重组核糖核酸酶抑制剂）一起在37 ℃下孵育1-2 h；然后将上述溶液在95 ℃下加热10-30 min以结束延伸反应，整个反应在光照保护下进行；（3）端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶的形成：在实验之前，将发夹DNA1（H1）和发夹DNA2（H2）分别加热至95 ℃保持5-10 min，然后通过聚合酶链式反应（PCR）机以1 ℃/min的速度逐渐退火至室温以形成发夹结构，并储存在4 °C以备进一步使用；随后，将端粒酶延伸产物（与一系列不同数量的HeLa细胞一起温育）加入到含有300-500 nM H1和300-500 nM H2的缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mMMgCl2）中；将混合物在37 ℃下孵育40-60 min之后，分别加入5-10 mM KCl和1-5 μM氯化血红素，然后将溶液在室温下放置30-60 min以形成G-四链体/血红素DNA酶； 1.4 将步骤1.2中制备的GOx-TiO2-C3N4修饰FTO导电玻璃作为工作阳极，利用标准三电极体系结合步骤1.3中形成的端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶和TMB溶液，构建具有即时可视化比色显示的光电化学生物传感器：用标准三电极系统中的电化学分析仪（CHI660D）测量光电流响应，将步骤1.2中GOx-TiO2-C3N4修饰的FTO导电玻璃作为工作阳极，铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，电解质溶液为150-300 μL含有5-10 mM葡萄糖的PBS溶液（50 mM，PH 7.4），在葡萄糖氧化酶的作用下产生过氧化氢，进一步促进工作电极在500W氙灯的照射下促进载流子分离与空穴传输，实现光能向电能的转化；然后将步骤1.3形成的端粒酶-G-四链体/血红素DNA酶和50-100 μL TMB加入上述电解液中一起温育，其室温下进行的HRP模拟反应催化过氧化氢产生羟基自由基氧化TMB产生无色向蓝色的可视化转变，且消耗的过氧化氢使得光电信号出现不同程度的减弱，从而实现定量测量端粒酶的效果。
所属类别：	发明专利