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原文传递通过质谱法测定BRAF突变和野生型BRAF蛋白的方法

专利名称：	通过质谱法测定BRAF突变和野生型BRAF蛋白的方法
摘要：	本发明公开了一种用于测定生物样品中野生型(WT)BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的方法，其包括以下步骤：a)通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C‑端切割成谷氨酸残基或将肽键C‑端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，以获得包含由所述蛋白酶消化所述肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型(WT)B‑raf蛋白与一种所述BRAF蛋白变体之间不同。b)使用质谱技术定量测定消化野生型(WT)B‑raf蛋白产生的所述肽片段的摩尔量和消化野生型(WT)B‑raf蛋白的变体产生的所述肽片段的摩尔量。以及，c)基于所述定量评估，计算所述WT BRAF蛋白与其所述变体之间的至少一个具体比值。此外，公开了一种用于评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性的方法。另外，公开了一种治疗患有BRAF相关疾病的受试者的方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	瑞典;SE
申请人：	特里特福尔莱弗公司
发明人：	G·马尔科-瓦尔加;C·韦林德;Y·杉原
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201780078506.6
公开号：	CN110291403A
代理机构：	北京汇知杰知识产权代理有限公司
代理人：	杨巍;蔡伦
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	瑞典隆德
主权项：	1.用于测定生物样品中野生型(WT)BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的方法，包括以下步骤： a)通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，以获得包含通过所述蛋白酶消化所述肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型(WT)B-raf蛋白与BRAF蛋白变体之间不同； b)使用质谱技术定量测定消化野生型(WT)B-raf蛋白产生的肽片段的摩尔量和消化所述野生型(WT)B-raf蛋白的变体产生的肽片段的摩尔量；以及 c)基于定量评估，计算所述WT BRAF蛋白与其变体之间的至少一个具体比值。 2.权利要求1的方法，其中所述BRAF蛋白变体是在对应于WT BRAF中第600位氨基酸的位置上突变的变体，所述位置在所述WT BRAF中为缬氨酸。 3.权利要求2的方法，其中所述BRAF蛋白变体是BRAF V600E、V600D、V600R和/或V600K。 4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是谷氨酰内肽酶(Glu-C)。 5.权利要求1和4中任一项的方法，其中所述消化步骤包括用乙酸铵、碳酸氢铵和/或磷酸盐缓冲液处理所述样品。 6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述样品是肿瘤组织样品或体液。 7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述样品是肿瘤组织，所述肿瘤组织是来自恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑肿瘤癌、低级神经胶质瘤或卵巢癌肿瘤的组织。 8.权利要求1至7中任一项的方法，其中由消化所述定量评估步骤中使用的野生型(WT)B-raf蛋白产生的多肽片段是根据SEQ ID 1和/或SEQ ID 8的多肽。 9.权利要求3的方法，由消化所述定量评估步骤中测量的所述野生型(WT)B-raf蛋白的蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 6、SEQID 7、SEQ ID 9和/或SEQ ID 10的多肽。 10.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述质谱技术是与质谱技术连接的液相色谱。 11.权利要求8的方法，其中所述与质谱技术连接的质谱液相色谱是HPLC/ESI-MS。 12.用于评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性的方法，包括以下步骤： (i)提供来自患有BRAF相关疾病的受试者的样品；以及通过根据权利要求1至9中任一项的方法测定WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比； (ii)将WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比与WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的； (iii)基于所述比较，确定所述受试者对给定药物治疗的敏感性，其中所述样品中WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值高于WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加。 13.权利要求12的方法，其中所述药物治疗是使用激酶抑制剂如维莫非尼、达拉非尼或索拉非尼进行治疗。 14.权利要求12或13的方法，其中在治疗前和治疗后监测受试者对给定药物治疗的敏感性，其中WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比在操作前与操作后的变化表示所述肿瘤组织的突变状态的变化。 15.治疗患有BRAF相关疾病的受试者的方法，包括提供以下步骤： (i)提供来自患有BRAF相关疾病的受试者的样品；以及通过根据权利要求1至9中任一项的方法测定WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比； (ii)将WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比与WT BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的； (iii)基于所述比较，确定所述受试者对给定药物治疗的敏感性，其中所述样品中WTBRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值高于WT BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加；以及 (iv)如果发现患者对给定药物治疗具有敏感性，则以规定的或限定的日剂量(DDD)施用所述药物治疗的药物规定的治疗期，或者如果发现所述患者对给定的药物治疗不敏感，则开始替代治疗，如手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法和/或对所述BRAF相关疾病有益的其它治疗。
所属类别：	发明专利