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原文传递一种检测表达癌胚抗原细胞的方法及其应用

专利名称：	一种检测表达癌胚抗原细胞的方法及其应用
摘要：	本发明涉及一种检测表达癌胚抗原细胞的方法及其应用。利用噬菌体展示技术将抗癌胚抗原的单链抗体展示在辅助噬菌体M13KO7表面，以构建抗癌胚抗原单链抗体文库。用这个文库作为探针，特异性靶向结合表达癌胚抗原的细胞，然后利用经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获这类细胞。通过PCR扩增M13KO7的g3p基因从而达到快速、灵敏检测单个表达癌胚抗原细胞或低含量的循环肿瘤细胞的目的。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	扬州大学
发明人：	周昕;侯金秀
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910576390.X
公开号：	CN110231484A
代理机构：	南京天华专利代理有限责任公司
代理人：	竞存;徐冬涛
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	225009 江苏省扬州市大学南路88号扬州大学
主权项：	1.一种检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)通过噬菌体展示技术，利用辅助噬菌体M13KO7构建抗癌胚抗原单链抗体噬菌体文库M13KO7-ACEAscFv，作为探针； (2)将步骤(1)构建得到的探针M13KO7-ACEAscFv与待检测样本靶向结合； (3)制备经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子； (4)采用步骤(3)制备得到的经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获步骤(2)得到的结合细胞； (5)通过M13KO7 g3p引物PCR扩增步骤(4)捕获的结合细胞中噬菌体的g3p蛋白基因，1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，如待检测样本包括表达癌胚抗原的细胞，则出现阳性条带。 2.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤为： a)将抗癌胚抗原单链抗体序列重链可变区和轻链可变区经(Gly4Ser)3连接，克隆至pCANTAB5E载体，得到重组质粒pCANTAB5E-ACEAscFv； b)将重组质粒pCANTAB5E-ACEAscFv转化至TG1感受态细胞，挑选阳性克隆接种至2xYT培养基，菌液培养至OD600为0.6-0.8时，将菌液以1:100接种至新的2xYT培养基扩大培养，培养至OD600为0.5时，以病毒感染复数0.01的比例加入辅助噬菌体M13KO7；培养，收集菌液，离心，收集沉淀； c)将步骤(b)中收集的沉淀重新加入2xYT重悬沉淀培养物，培养12h，收集菌液，离心收集上清并加入2.5MNacl/20％PEG 8000，冰浴1h，离心，沉淀用1xPBS重悬，该悬液为表达抗癌胚抗原单链抗体的噬菌体抗体库，命名为M13KO7-ACEAscFv。 3.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为： a)探针M13KO7-ACEAscFv与待检测样本以病毒感染复数不低于0.01的比例混合，于旋转混匀仪上室温混匀15～120min；优选的，混匀30min； b)3000rpm离心3min，去除上清，加入HBSS重悬，移至新的EP管3000rpm离心3min去除上清； c)重复操作b)3次，以去除多余未结合的M13KO7-ACEAscFv，制备得到与探针M13KO7-ACEAscFv靶向结合的待检测样本。 4.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤为： a)以摩尔比为1:106～1:109取包被有蛋白G的磁纳米粒子和抗癌胚抗原抗体于新的EP管中，1xPBST定容，置于旋转混匀仪上室温混匀4h； b)磁性分离后去除上清，加入1x PBST洗涤3次； c)加入2％BSA置于旋转混匀仪上室温封闭2h，重复操作b)，1x PBST重悬备用，得到经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子。 5.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(4)的具体步骤为： a)取HBSS重悬步骤(2)制备得到的与探针M13KO7-ACEAscFv靶向结合的待检测样本细胞，加入步骤(3)制备得到的经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子，于旋转混匀仪上室温混匀30min，使经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获步骤(2)得到的结合细胞； b)将捕获的结合细胞磁性分离，去除上清中未结合的M13KO7-ACEAscFv和细胞，HBSS清洗3次，加入HBSS重悬。 6.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(5)所述M13KO7g3p引物包括： M13KO7 g3p-F：5’-CCGATGAAAACGCGCTACAG-3’(SEQ ID NO.1)； M13KO7 g3p-R：5’-AAGGGCGACATTCAACCGAT-3’(SEQ ID NO.2)。 7.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(5)所述PCR反应体系为：2xTaq Master Mix 12.5μL；M13KO7 g3p-F2μL；M13KO7 g3p-R2μL；模板DNA 2μL；ddH2O 6.5μL。 8.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(5)所述PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸15s，25个循环；72℃延伸5min。 9.权利要求1至8任一项所述的检测表达癌胚抗原细胞的方法在检测单个表达癌胚抗原细胞中的应用。 10.权利要求1至8任一项所述的检测表达癌胚抗原细胞的方法在检测低含量的循环肿瘤细胞中的应用。
所属类别：	发明专利