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原文传递一种检测人免疫球蛋白G4的方法和试剂盒

专利名称：	一种检测人免疫球蛋白G4的方法和试剂盒
摘要：	本发明涉及一种检测人免疫球蛋白G4的方法和试剂盒，属于医学检验技术领域。一种检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法，使用了两个高特异性抗IgG4Fc片段的单克隆抗体，第一个对IgG4特异的单克隆抗体与固相载体结合，第二个对IgG4特异的单克隆抗体被一种过氧化酶标记。通过与待测样本中IgG4的桥联作用形成第一IgG4单克隆抗体‑IgG4‑酶标第二IgG4单克隆抗体的复合物并固定与固相载体上。本发明采用高效清洗液去除样本中非特异性干扰物质成分。本发明对生物样本IgG4含量的检测方法实现了对生物样本中IgG4定量检测的高稳定性和高特异性，并准确定量待测物IgG4在人生物样本中的浓度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山西;14
申请人：	山西瑞豪生物科技有限公司
发明人：	王敏兰;牛林茹;陈婷婷;张旋旋;奚瑞芳;阎婧;杨武
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201910205576.4
公开号：	CN110297093A
代理机构：	天津欣达睿诚知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	李欣
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	030025 山西省太原市晋源区果树场南晋祠路三段579号
主权项：	1.一种检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法，其特征在于：使用两个高特异性抗IgG4Fc片段的单克隆抗体，第一个对IgG4特异的单克隆抗体与固相载体结合，该抗体为第一IgG4单克隆抗体，第二个对IgG4特异的单克隆抗体被一种过氧化酶标记，该抗体为第二IgG4单克隆抗体；第一IgG4单克隆抗体和第二IgG4单克隆抗体均与检测样本中存在的IgG4结合，形成第一IgG4单克隆抗体-IgG4-酶标第二IgG4单克隆抗体的复合物并固定于固相载体上；第一IgG4单克隆抗体和第二IgG4单克隆抗体对IgG4的结合不构成竞争，且由于两个对IgG4特异结合的单克隆抗体均结合于IgG4分子的Fc段而具有高稳定性；固相载体上的第一IgG4单克隆抗体与被检测样本中的IgG4结合呈现剂量相关性，被结合的IgG4依然保持与氧化酶标记的第二IgG4单克隆抗体的结合，并根据被结合的IgG4的量决定氧化标记的第二IgG4单克隆抗体的量，由第二IgG4单克隆抗体标记的氧化酶与酶底物的生色反应定量被测样本中存在的IgG4。 2.根据权利要求1所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法，其特征在于：第一IgG4单克隆抗体是英国抗体制剂公司生产的抗人IgG4重链单克隆抗体(Abcam，ab1930)；第二IgG4单克隆抗体为Abcam公司生产的IgG4Fc段酶标记单克隆抗体(Abcam，ab99817)。 3.根据权利要求1或2所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法，其特征在于包括如下步骤： 1)处理待测样本：以体积比1∶10000稀释待检测样品，取10μL样品加入到1mL样品稀释液中，震荡混匀，从其中取10μL加入到1mL样品稀释液中，震荡混匀； 2)加样：向包被有第一IgG4单克隆抗体的固相载体容器中加入不同浓度的IgG4标准品溶液和稀释的待测样本，100μL/孔，用封板膜封板后置20℃-28℃室温静置30分钟，使其与固定在固相载体容器上的第一IgG4单克隆抗体Fc片段结合； 3)洗涤：清洗去除固相载体容器中未结合的样本成分，每次每孔加入300μL高效清洗液，清洗4-6次，在吸水纸上拍干； 4)加酶标二抗：向固相载体容器中加入高特异性的辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二IgG4单克隆抗体溶液，每孔加入100μL，用封板膜封板后置20℃-28℃室温静置30分钟，使酶标记的第二IgG4单克隆抗体与待测样本中的IgG4结合，从而使酶标第二Ig64单克隆抗体固定在微孔板上； 5)洗涤：清除固相载体中未结合的酶标第二IgG4单克隆抗体，每次每孔加入300μL高效清洗液，清洗4-6次，在吸水纸上拍干； 6)显色：向固相载体容器中加入TMB(四甲基联苯胺)显色，将显色A液和B液按1∶1比例混匀，每孔加入100μL，室温避光轻震15分钟；TMB在HRP酶的催化下形成蓝色的阳离子产物； 7)终止：向固相载体容器中每孔加入终止液50μL，轻震混匀以终止反应，蓝色溶液转变为黄色；在单波长450nm或双波长450/630nm下依序测量各孔的OD值用分光光度计测定有色溶液的OD值； 8)通过标准曲线法测定待测样本中IgG4的值： A.绘制标准曲线：计算每个浓度标准品双复孔OD值的平均值，以标准品的浓度(ng/mL)为横坐标，对应的OD值为纵坐标，使用数据分析软件(Origin8)绘制标准曲线； B.结果判断：根据正常人群IgG4样本浓度均值+3SD为阳性判断值(cut-off值，0.212g/L)，对≥0.212g/L的样本判定为阳性样本；＜0.212g/L判定为阴性样本。检测值在0.173g/L-0.212g/L范围内提示接近阳性判定值，建议复测。 4.根据权利要求3所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法，其特征在于：所述固相载体容器为96孔或48孔聚苯乙烯酶标板；所述待测样本为标准品、人血清或血浆；所述第一IgG4单克隆抗体指鼠抗人IgG4Fc片段的单克隆抗体，所述第二IgG4单克隆抗体指鼠抗人IgG4Fc片段偶联HRP的单克隆抗体；所述包被第一IgG4单克隆抗体于固相载体的包被方法为：每100ML包被液由0.05M碳酸盐缓冲液、第一IgG4单克隆抗体和纯化水组成；固相载体容器的每孔加100μL包被液，置4℃过夜。 5.根据权利要求3所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤5)使用一种高效清洗液进行清洗。 6.根据权利要求5所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法，其特征在于：所述高效清洗液的成分和浓度如下：纯化水400mL，Na2HPO4·12H2O 21.789g，KCl5.78g，KH2PO42.916g，NaCl86.4g，Tween-207.2mL，Proclin132μL，各成分充分溶解后，加纯化水定容至540mL。 7.根据权利要求3所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(5)的清洗方法为：洗板机洗板，5次，每次每孔300μL清洗液，在吸水纸上拍干。 8.一种检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂： 1)第一IgG4单克隆抗体包被的酶标板：包被酶标板的包被液中第一IgG4单克隆抗体的浓度范围为0.1μg/mL-10μg/mL； 2)人IgG4标准品：为6个不同浓度的人IgG4标准品溶液(Abcam，ab90286)，标准品A为50ng/mL、标准品B为25ng/mL、标准品C为12.5ng/mL、标准品D为6.25ng/mL、标准品E为3.125ng/mL、标准品F为0ng/mL；各标准品均为1mL/瓶，各1瓶； 3)对照品：人IgG4(Abcam，ab90286)阳性对照品1mL/瓶，正常人血清(Jackson，货号为009-000-001)阴性对照品1mL/瓶，1瓶； 4)辣根过氧化物酶标记的第二IgG4单克隆抗体溶液：150mL/瓶，第二IgG4单克隆抗体浓度0.3μg/mL/瓶，1瓶； 5)样本稀释液：20倍浓缩PBST，15mL/瓶，1瓶； 6)显色液：显色A液，由无水醋酸钠0.3142g、β-环状糊精0.2025g、过氧化氢脲0.0697g和纯化水组成，8mL/瓶，1瓶；显色B液，由含柠檬酸0.2355g10MNaOH 24.3μL、丙三醇6.2mL和纯化水组成，8mL/瓶，1瓶； 7)终止液：浓度为2mol/L的硫酸溶液，10mL/瓶，1瓶； 8)洗涤液：20倍浓缩PBST，50mL/瓶，1瓶。 9.根据权利要求8所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有锡箔袋、封膜板和说明书。 10.权利要求1至7所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的方法和权利要求8、9所述的检测样本中人免疫球蛋白G4(IgG4)的试剂盒用于IgG4相关性疾病(IgG4-RD)”的样品的检测和研究的用途。
所属类别：	发明专利