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原文传递一种基于光热释放信号增强型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器

专利名称：	一种基于光热释放信号增强型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器
摘要：	本发明公开一种基于光热释放信号增强型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器。该传感器的构建方法是以硅基二氧化钛磁珠作为基底固定甲状腺球蛋白抗体，以吸附联吡啶钌的介孔二氧化硅标记甲状腺球蛋白作为信号探针，通过抗原与抗体之间特异性识别构建出一种竞争型免疫传感器。将修饰抗体的电极放入含有不同浓度游离抗原和一定量信号探针的混合溶液中，使游离的目标抗原与信号探针竞争结合抗体，结合了信号探针的电极能产生一定的发光强度。在808nm红外激光器的照射下，传感界面迅速升温，介孔二氧化硅吸附的联吡啶钌释放，发光信号随温度升高显著增强，从而实现了信号放大。且随着游离目标物浓度的增加，抗体结合信号探针的数量减少，发光强度也随之减小，基于该现象可建立起对甲状腺球蛋白的电致化学发光分析方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福建师范大学
发明人：	戴宏;任卉竹;赵丹丹;张书培;高利红
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910670775.2
公开号：	CN110308286A
代理机构：	福州智理专利代理有限公司
代理人：	王义星
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	350108 福建省福州市闽侯县上街镇学园路福建师大旗山校区福建师大科研处
主权项：	1.一种基于光热释放信号增强型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）的预处理：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG/Ab/MB修饰电极的制备：将5 mg的磁珠（MB）粉末溶于1 mL20 wt.%乙醇，然后，取3 μL MB溶液滴涂于干净的玻碳电极表面，在烘箱中烘干，冷却至室温，再取3 μL 1mM巯基乙胺水溶液滴涂在电极上，4 °C下功能化40 min；取10μL 浓度比为4:1的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液加入到1ng/mL甲状腺球蛋白抗体(Ab)溶液中，在4℃下活化40 min；将上述修饰电极浸入活化后的Ab溶液中，在4 °C下孵育50 min；随后用pH 7.4的磷酸缓冲溶液（PBS）去除多余的Ab，最后将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA水溶液1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到Ab/MB修饰电极；将甲状腺球蛋白标准溶液（TG）配制成不同浓度的标准溶液分别与MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG标记探针溶液混合形成混合溶液，并将Ab/MB修饰电极浸入上述混合溶液，于4 °C下孵育50 min，通过竞争反应使MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG标记探针结合在修饰电极表面；用pH 7.4的PBS冲洗电极表面残余液并在室温条件下自然晾干，即得到MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG/Ab/MB修饰电极；（4）甲状腺球蛋白的检测：采用三电极体系进行测定，以MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG/Ab/MB修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在电化学工作站上对甲状腺球蛋白进行检测，将电化学工作站和化学发光检测仪连接并将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~1.6 V，扫描速率0.15 V/s；在pH 8.0的PBS中，通过电致化学发光方法，对1×10-1 μg/mL~1×10-7 μg/mL一系列不同浓度的甲状腺球蛋白标准溶液在修饰电极上产生的电致化学发光信号强度进行测定，绘制工作曲线；将待测样品溶液代替甲状腺球蛋白标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的介孔二氧化硅(MPS)由下述方法制备：称取0.5 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶于240 mL超纯水中，加入3.5 mL 2.0 M 氢氧化钠溶液，充分搅拌下将混合溶液升温至80 °C，保温反应30 min，缓慢滴加2.5 mL 正硅酸乙酯（TEOS），随后在80 °C下继续搅拌反应2 h，将该混合物离心10 min，所得沉淀用超纯水和乙醇各洗涤三次，真空干燥后得到白色固体；最后，取0.5 g所得固体加入到50 mL甲醇和2.5 mL 37wt%的浓盐酸混合溶液中，加热回流16 h，过滤所得沉淀分别用超纯水和甲醇洗涤三次，并在真空60 °C下干燥去除孔道内残留的溶剂，即得到介孔二氧化硅。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG标记探针溶液由下述方法制备：1) 介孔二氧化硅吸附联吡啶钌[MPS-Ru(bpy)32+]的制备：首先，将50μL 10 mg/mL 的介孔二氧化硅（MPS）水溶液与50 μL 10 mM的联吡啶钌[Ru(bpy)32+]溶液摇匀吸附6 h，将混合液离心10 min得到沉淀物用100 μL超纯水洗涤并稀释；然后，在溶液中加入10 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）功能化12 h，并用超纯水洗涤，在溶液中加入10μL 5 wt.%戊二醛4 ℃下交联1 h；2) 介孔二氧化硅吸附联吡啶钌标记抗原[MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG]的制备：取50 μL上述[MPS-Ru(bpy)32+]溶液加入30 μL 1 ng/mL 甲状腺球蛋白标准溶液（TG）与20 μL 1 mM四乙烯五胺（TEPA）的混合溶液中，在4 ℃下反应50min，并用1.0 wt.%的BSA水溶液封闭；最后，将该混合物离心10 min，用50 μL超纯水分散沉淀物，即得到MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG标记探针溶液，用pH 7.4的PBS分散，再加入20 μLBSA水溶液，放置4 °C条件下备用。 4.一种基于介孔二氧化硅光热释放信号增强型的甲状腺球蛋白免疫传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG/Ab/MB修饰电极，所述的MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG/Ab/MB修饰电极由下述方法制备而成的：1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG/Ab/MB修饰电极的制备：将5 mg的磁珠（MB）粉末溶于1 mL 20 wt.%乙醇，然后，取3 μL MB溶液滴涂于干净的玻碳电极表面，在烘箱中烘干，冷却至室温，再取3 μL 1 mM巯基乙胺水溶液滴涂在电极上，4 °C下功能化40min；取10 μL 浓度比为4:1的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液加入到1 ng/mL甲状腺球蛋白抗体(Ab)溶液中，在4℃下活化40 min；将上述修饰电极浸入活化后的Ab溶液中，在4 °C下孵育50 min；随后用pH 7.4的磷酸缓冲溶液（PBS）去除多余的Ab，最后将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA水溶液1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到Ab/MB修饰电极；将TG配制成不同浓度的标准溶液分别与MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG标记探针溶液混合形成混合溶液，并将Ab/MB修饰电极浸入上述混合溶液，于4 °C下孵育50 min，通过竞争反应使MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG标记探针结合在修饰电极表面；用pH 7.0的PBS冲洗电极表面残余液并在室温条件下自然晾干，即得到MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG/Ab/MB修饰电极。 5.权利要求4所述的一种基于光热释放信号增强型电致化学发光免疫传感器对甲状腺球蛋白的检测方法，其特征在于，步骤如下：1）采用三电极体系进行测定，以MPS-Ru(bpy)32+/TEPA/TG/Ab/MB修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在电化学工作站上对甲状腺球蛋白进行检测，将电化学工作站和化学发光检测仪连接并将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~1.6 V，扫描速率0.15 V/s；2）在pH 8.0的PBS中，通过电致化学发光方法，对1×10-1 μg/mL~1×10-7 μg/mL一系列不同浓度的甲状腺球蛋白标准溶液在修饰电极上产生的电致化学发光信号强度进行测定，绘制工作曲线；将待测样品溶液代替甲状腺球蛋白标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
所属类别：	发明专利