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原文传递基于光热增强的比率型电致化学发光免疫传感器对卵巢癌标记物的检测方法

专利名称：	基于光热增强的比率型电致化学发光免疫传感器对卵巢癌标记物的检测方法
摘要：	本发明公开一种基于光热增强的比率型电致化学发光免疫传感器对卵巢癌标记物的检测方法，其特点是首次引入羧基化的石墨相氮化碳和四苯基卟啉掺杂的共轭聚合物点两种发光试剂，并将其分别功能化到介孔SiO2纳米球（ms‑SiO2）和碳纳米角（CNHs）上，构建一种比率型电致化学发光免疫传感器，用于卵巢癌标志物的检测。其中具有大比表面积的ms‑SiO2作为生物传感器平台可以负载大量的生物分子和发光试剂，此外，将聚合物点固载到具有高导电性和丰富活性位点的CNHs表面。在808 nm激光照射下，具有光热性质的CNHs和聚合物点能够引起电极表面温度升高，增强电致化学发光信号，最终实现对卵巢癌标志物HE4的灵敏检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福建师范大学
发明人：	戴宏;任卉竹;韩晴;房丹丹;宋建榕;衣欢;郑祥钦;高利红
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910159789.8
公开号：	CN109781714A
代理机构：	福州智理专利代理有限公司
代理人：	王义星
分类号：	G01N21/76(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	350108 福建省福州市闽侯县上街镇学园路福建师大旗山校区福建师大科研处
主权项：	1.一种基于光热增强的比率型电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）取500 uL 5 mg/mL羧基化的石墨相氮化碳（g-C3N4-COOH）与500 uL 浓度为3 mg/mL的介孔SiO2纳米球（ms-SiO2）超声混合均匀，在室温下机械搅拌5小时, 离心，洗涤去除多余的g-C3N4-COOH，得到g-C3N4-COOH@ms-SiO2复合物；滴加3 uL上述所制得的 g-C3N4-COOH@msSiO2复合物溶液于处理过的电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得g-C3N4-COOH@ms-SiO2修饰电极；（3）将步骤（2）所制得的修饰电极浸入到60 uL浓度比为2:1 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液中40分钟，以达到活化羧基的目的，烘干后，滴加3 μL 浓度为4.2 ug/mL人附睾蛋白4抗体（Ab1）于修饰电极表面，室温下孵育40分钟，用去离子水冲洗电极表面，制得Ab1/g-C3N4-COOH@ms-SiO2修饰电极；（4）将10 mg 的碳纳米角（CNHs）超声溶解于2 mL 的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，得到分散均匀的CNHs溶液；随后，取体积比为 1:1的CNHs溶液与四苯基卟啉掺杂的共轭聚合物（Pdots）溶液在室温下混合震荡5 小时，离心、洗涤制得CNHs@Pdots复合物；然后取浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入到所制得的CNHs@Pdots复合物溶液中，室温下振荡50 分钟，再加入100 uL浓度为50 μg/mL人附睾蛋白4兔多克隆抗体（anti-Rabbit IgG，Ab2），室温下反应50分钟后，离心、洗涤，制得CNHs@Pdots-Ab2复合物溶液；最后，向上述溶液中加入1 wt% BSA 封闭非特异性吸附位点，用去离子水洗去多余的试剂后，制得CNHs@Pdots-Ab2复合物溶液，储存在4°C冰箱中备用；（5）将步骤（3）制得的Ab1/g-C3N4-COOH@ms-SiO2修饰电极浸入不同浓度的人附睾蛋白4（HE4）标准溶液中30分钟，用去离子水冲洗电极表面，制得HE4/BSA/Ab1/g-C3N4-COOH@ms-SiO2修饰电极；然后滴加5 uL步骤（4）制得的CNHs@Pdots- Ab2复合物溶液于HE4/BSA/Ab1/g-C3N4-COOH@ms-SiO2修饰电极上，室温下孵育50分钟，用去离子水冲洗电极表面，制得CNHs@Pdots-Ab2/HE4/BSA/Ab1/g-C3N4-COOH@ms-SiO2修饰电极，并保存在4 °C冰箱中备用。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的羧基化的石墨相氮化碳（g-C3N4-COOH）由下述方法制备的：将5.0 g双氰胺以2.3 °C/min 的升温速率加热到550 °C，4小时后，再以1 °C/min 的速率冷却至室温，制得黄色产物；在研钵中研磨一段时间后，再将产物转移到陶瓷坩埚中，在550 °C下加热2小时，得到黄色的g-C3N4粉末；随后，取 1 g黄色的g-C3N4粉末溶解于含H2SO4和HNO3混合酸溶液中，混合酸溶液中H2SO4和HNO3体积比= 3：1，并在室温下剧烈搅拌12小时，多次离心，洗涤，得到pH为7的混合溶液；最后，在35 °C温度下干燥12 小时，制得羧基化的g-C3N4；所述的四苯基卟啉掺杂的共轭聚合物（TPP-doped PFBTPdots）由下述方法制备的：将1 mg/mL聚[ (9,9-二辛基芴-2,7-二基)-交替-(2,1,3-苯并噻唑)]（PFBT）、1 mg/mL聚(苯乙烯-共马来酸酐)（PSMA）和1 mg/mL四苯基卟啉（TPP）分别溶解在不同体积的四氢呋喃（THF）溶液中，得到浓度为100 µg/mL聚合物PFBT、20 µg/mL 功能聚合物PSMA 、5 µg/mL光敏剂TPP.，三者超声混合得到分散均匀的混合溶液；然后将10 mL去离子水快速加入所获得的混合溶液中并在超声波水浴仪中超声一段时间，使溶液分散均匀；充氮气去除THF后，再用0.22 µm滤膜过滤得到的溶液，最后，在温度为55 °C的旋转蒸发仪中蒸发浓缩溶液，得到目标产物。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的介孔SiO2纳米球（ms-SiO2）由下述方法制备的：50 mL正硅酸乙酯（TEOD）快速加入到含80 mL乙醇、100 mL二次蒸馏水和30 mL的氨水的混合溶液中，在25 °C温度下搅拌12 h，得到溶液A；其次，将1.87 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和0.6 g尿素超声溶解于30 mL超纯水中形成溶液B；随后，将溶液A和溶液B迅速混合，室温下搅拌0.5小时后，将混合液转移到50 mL四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，120°C温度下加热4 h，待冷却至室温后，离心、洗涤、干燥，再在550 °C温度下煅烧6小时，得到最终产物。 4.权利要求1-3任一所述的方法制备的一种光热增强检测卵巢癌标记物的比率型电致化学发光免疫传感器。 5.权利要求4所述的一种光热增强检测卵巢癌标记物的比率型电致化学发光免疫传感器，其特征在于，用于卵巢癌标记物人附睾蛋白4（HE4）检测，检测步骤如下：（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以权利要求4所述的一种光热增强检测卵巢癌标记物的比率型电致化学发光免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试；（2）采用电位范围-1.5 -1.5 V，扫描速率0.15 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的人附睾蛋白4(HE4)标准溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集1.3 V的ECL信号强度（ECLg-C3N4-COOH）和-1.3 V 的ECL信号强度（ECLPdots），通过其比率值与人附睾蛋白4（HE4）标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；（3）待测样品溶液代替人附睾蛋白4（HE4）标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
所属类别：	发明专利