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原文传递一种HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法

专利名称：	一种HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法
摘要：	本发明属于生物分析技术领域，具体公开了一种HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法，包括以下步骤：S1、样品采集；S2、样品预处理；S3、HPLC测定：流动相B：含0.1％乙酸的水溶液：甲醇(9：1，v：v)；流动相C：甲醇；采用梯度洗脱；S4、定量分析：建立尿酸浓度与峰面积的标准曲线、以及尿酸酶浓度与尿素消耗量的标准曲线，根据回归方程计算出尿酸酶的浓度。本发明的尿酸酶浓度分析方法具有更广的线性范围，且操作简单、灵敏度和精密度高、专属性和重现性好、回收率高，可以实现快速、准确地对血浆样品中尿酸酶的定量分析，在0.25～20.0μg/mL范围内皆可准确定量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉海谱生物医药科技有限公司
发明人：	吴琳;郏自明;胡汉高;李盈;王祥艳
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910661821.2
公开号：	CN110308232A
代理机构：	南京纵横知识产权代理有限公司
代理人：	徐瑛
分类号：	G01N30/06(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区东一产业园光谷大道金融后台服务中心基地建设项目二期B5幢16层2号02室
主权项：	1.一种HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、样品采集：采集全血后离心，获得血浆样品； S2、样品预处理：步骤S1的血浆样品：尿酸溶液按体积比1：3混匀，水浴反应10min，加1/2体积的高氯酸终止反应，立即冰浴5min，然后低温高速离心，取上清，得到待测样品； S3、HPLC测定：色谱条件为：色谱柱：SymmetryC18；流速：1.20mL/min；检测波长：288nm；流动相B：含0.1％乙酸的水溶液：甲醇(9：1，v：v)；流动相C：甲醇；采用梯度洗脱，梯度洗脱的程序为： 0-0.80min：95％(vt)流动相B+5％(vt)流动相C； 0.80-1.80min：90％(vt)流动相B+10％(vt)流动相C； 1.80-2.80min：90％(vt)流动相B+10％(vt)流动相C； 2.80-3.50min：85％(vt)流动相B+15％(vt)流动相C； 3.50-3.60min：95％(vt)流动相B+5％(vt)流动相C； 3.60-5.50min：95％(vt)流动相B+5％(vt)流动相C； S4、定量分析：建立尿酸浓度与峰面积的标准曲线、以及尿酸酶浓度与尿素消耗量的标准曲线，根据回归方程计算出尿酸酶的浓度。 2.如权利要求1所述的HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法，其特征在于，步骤S2中，取上清，加入2倍体积的0.1％乙酸的水溶液：甲醇(9：1，v：v)，得到待测样品。 3.如权利要求1所述的HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法，其特征在于，步骤S2中，所述尿酸溶液浓度为1000μM。 4.如权利要求1所述的HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法，其特征在于，步骤S2中，所述低温高速离心条件为10000r/min、4℃。 5.如权利要求1所述的HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法，其特征在于，步骤S4中，所述尿酸浓度与峰面积的标准曲线的建立包括以下步骤： P1、以甲醇为溶剂配制2.00mM的尿酸储备液，用硼酸－硼砂缓冲溶液稀释尿酸储备液配制浓度梯度范围为10.0～1000uM的尿酸标准溶液； P2、取尿酸标准溶液，加入2倍体积的0.1％乙酸的水溶液：甲醇(9：1，v：v)，混合均匀； P3、进样测定，以尿酸浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法得线性回归方程Y＝2704.55X-5522.88，r2＝0.9916(X为尿酸浓度，单位为μM)。 6.如权利要求1所述的HPLC法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法，其特征在于，步骤S4中，所述尿酸酶浓度与尿素消耗量的标准曲线的建立包括以下步骤： Q1、以PBS缓冲液为溶剂配制浓度梯度范围为0.25～50.0μg/mL的尿酸酶标准溶液； Q2、酶反应：按体积比1：3分别向1000μM的尿酸溶液中加入不同浓度的尿酸酶标准溶液，水浴反应10min，加1/2体积的高氯酸终止反应，立即冰浴5min，然后低温高速离心，取上清，加入2倍体积的0.1％乙酸的水溶液：甲醇(9：1，v：v)，混合均匀； Q3、进样测定，以尿酸消耗量为纵坐标，尿酸酶浓度为横坐标，用加权最小二乘法得回归方程y＝-2.109x2+81.90x+61.89，r2＝0.994(x为尿酸酶浓度，单位为μg/mL)，其中，尿酸消耗量(μM)＝1000-1.5×尿酸测得浓度。
所属类别：	发明专利