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原文传递一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法

专利名称：	一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法
摘要：	一种牛奶中多重抗生素残留(氧四环素和卡那霉素)的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将抗生素适体(APT)与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SP和HP修饰在金纳米颗粒(AuNPs)表面。在抗生素存在时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HPKNA杂交形成SDB‑AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP结合SAv‑HRP后可催化SAv‑HRP后催化TMB‑H2O2或OPD‑H2O2溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测。该方法具有高灵敏度，低成本，易操作等特点，可实现样品中多重抗生素的灵敏测定。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京农业大学
发明人：	许媛媛;苗晋锋;张源淑
专利状态：	有效
申请日期：	2018-03-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-11T00:00:00+0800
申请号：	CN201810296905.6
公开号：	CN110320356A
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号
主权项：	1.一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将抗生素适体(APT)与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，探针SP和HP修饰在金纳米颗粒(AuNPs)表面；在抗生素存在时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HPKNA杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2或OPD-H2O2溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测。该方法具有高灵敏度，低成本，易操作等特点，可实现样品中多重抗生素的灵敏测定。 2.根据权利要求1所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是将抗生素适体(APT)与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，将20μL 10μM APT和20μL 10μM CP加入到210μL含0.3M NaCl，pH值为7.0的10mMPBS中，90℃加热2min后缓慢降至室温，之后加入50μL SDB，37℃孵育90min，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤3次后，加入500μL 2％BSA室温孵育1h后，将CPOTC/APTOTC修饰的SDB和CPKAN/APTKAN修饰的SDB分别重悬于50μL pH值为7.0的10mM PBS溶液中，最后将得到的CPOTC/APTOTC修饰的SDB和CPKAN/APTKAN修饰的SDB等体积混匀。 3.根据权利要求1所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是生物素修饰的探针SP和HP通过巯基修饰在AuNPs表面，将制备的AuNPs 100μL加入4μL 10μM的HP、40μL 10μM的SP和356μL pH值为7.0的10mM PBS于37℃孵育1h，12000rpm，4℃离心20min，用pH值为7.0的10mM PBS重复离心洗涤3次得到HPOTC/SPOTC修饰的AuNPs和HPKNA/SPKNA修饰的AuNPs。 4.根据权利要求1所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是当体系中存在抗生素(氧四环素和卡那霉素)时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HP杂交形成SDB-AuNPs体系，将上述权利要求2中CPOTC/APTOTC修饰的SDB和CPKAN/APTKAN修饰的SDB混合物4μL、4μL不同浓度(氧四环素或卡那霉素)的和2μL含0.1M NaCl，pH值为7.4的10mM PBS制成混合液并于37℃孵育1h，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤后加入12.5μL上述权利要求3中HPOTC/SPOTC修饰的AuNPs或HPKNA/SPKNA修饰的AuNPs于37℃孵育1h，用100μL pH值为7.0的10mM PBS清洗3次并重悬形成SDB-AuNPs体系。 5.根据权利要求1所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是AuNPs表面修饰的SP结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2或OPD-H2O2溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，测定一系列标准浓度抗生素的紫外吸光度的大小绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测，将上述权利要求4中形成SDB-AuNPs体系中加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)于37℃下孵育1h，用200μL PH值为6.0的10mM PBS清洗5次，加600μL TMB-H2O2或OPD-H2O2溶液重悬磁珠于37℃孵育30min后观察颜色变化并检测370nm或450nm处紫外吸光度，测定一系列标准浓度抗生素的紫外吸光度的大小绘制标准曲线，绘制标准曲线，用人工污染牛奶的方法获得氧四环素(或卡那霉素)的牛奶样品替代上述不同浓度的氧四环素(或卡那霉素)标准溶液，得到紫外吸光度通过标准曲线可计算出实际牛奶中抗生素的浓度。
所属类别：	发明专利