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原文传递一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用

专利名称：	一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用
摘要：	本发明公开的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用。在高脂饮食小鼠制备的脂肪肝模型上，通过形态学和Western blotting方法证实硫化氢通过代谢性核受体FXR缓解脂肪肝。在293A细胞转染人His‑FXR质粒及FXR锌指结构半胱氨酸突变质粒，并给予硫化氢供体处理，通过改良生物素转换实验和锌离子荧光强度实验检测并验证FXR硫氢化修饰，并确定修饰位点，发现硫化氢可使肝脏FXR Cys138/141位点发生硫氢化修饰，增强FXR对肝脏脂质合成关键酶转录调控能力，最终减轻肝脏脂质蓄积。本发明准确得到FXR蛋白硫氢化修饰位点，为缓解非酒精性脂肪肝疾病提供了新途径。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	陕西;61
申请人：	西安医学院
发明人：	徐文静;王善伟;刘彦彤;张润岐;苏兴利
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201910481756.5
公开号：	CN110346555A
代理机构：	西安弘理专利事务所
代理人：	罗笛
分类号：	G01N33/535(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	710021 陕西省西安市含光北路74号
主权项：	1.一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建人His-FXR质粒；步骤2，突变分组：将步骤1中的人His-FXR质粒分为五组，前四组分别依次突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192位点，记为M1、M2、M3、M4，第五组突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192的全部位点，记为M1-4；步骤3，将步骤2突变后的五组人His-FXR质粒M1、M2、M3、M4、M1-4，分别加入293A细胞处理24h，随后再加入100μM NaHS处理2h，得到细胞处理液；步骤4，将经步骤3处理后的细胞处理液进行胞浆胞核蛋白分离，随后采用Westernblotting方法观察FXR表达情况；在步骤3收细胞前2h加入100μM NaHS，HEN Buffer收细胞并超声裂解，随后通过改良生物素转换实验检测FXR硫氢化修饰，得到初步FXR蛋白硫氢化修饰位点；步骤5，对步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点，通过锌离子荧光强度实验进行验证，确定FXR蛋白硫氢化修饰位点。 2.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤4中Western blotting方法具体为：步骤4.1，电泳：将步骤3的细胞处理液接通电源，电压强度浓缩胶为4-5V/cm，分离胶为6-7V/cm；步骤4.2，转膜：在电转槽中加入电转液，同时将硝酸纤维素膜和滤纸放入电转液中完全浸湿；将胶卸下，只保留目的片段胶，按顺序铺好滤纸、胶和膜；将用滤纸和膜夹好的胶平铺于海绵上，封紧后放入电转槽，在250mA电转2h；步骤4.3，封闭：将步骤4.2的膜从电转槽中取出，使用TBST洗掉膜上残留的电转液，先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后再浸没于封闭液中，室温缓慢摇动1小时；步骤4.4，孵育一抗：将经步骤4.3处理的膜从封闭液中取出，用滤纸吸干液体，放入孵育袋内，加入用封闭液稀释的一抗工作液FXR，室温下轻摇孵育1小时或在4℃孵育8-16h，一抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟；步骤4.5，孵育二抗：选择二抗兔抗，用封闭液按1:30000稀释，室温孵育1h；二抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟，准备发光；步骤4.6，发光：将经步骤4.5处理后的膜使用去离子水漂洗，用滤纸吸干水分，正面朝下覆于发光液上，孵育1～5分钟后置于保鲜膜内固定于片盒中，曝光、显影、定影，清水冲净晾干，标定marker，进行分析或扫描。 3.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点是：Cys138/141。 4.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤5中锌离子荧光强度实验的具体步骤为：步骤5.1，将293A细胞接种至10cm细胞培养皿，当密度为80％左右时加10μgFXR质粒过表达FXR，用试剂盒提取细胞核蛋白；步骤5.2，分组：将细胞核蛋白分为四组，分别为control组、NaHS组、DTT组和NaHS+DTT组，其中每组为100μl细胞核蛋白，NaHS组通过NaHS 100μM在37℃处理30min，DTT组通过DTT在37℃处理30min，NaHS+DTT组为依次使用NaHS 100μM、DTT 1mM在37℃处理30min；分组：将细胞核蛋白分为六组，分别为FXR质粒组、M1组、M2组和、M3组、M4组和M1-4组，其中每组为100μl细胞核蛋白，依次加入FXR质粒、FXR锌指结构M1、M2、M3、M4和M1-4继续培养36小时；每组100μl核蛋白分别用NaHS 100μM，DTT 1mM 37℃处理30min，或加FXR及FXR锌指结构不同位点突变质粒继续培养36小时；步骤5.3，用15μM锌离子和25μM锌离子荧光探针继续孵育30min；步骤5.4，脱盐柱洗脱多余的锌离子；步骤5.5，酶标仪检测锌离子荧光强度。 5.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤5中确定FXR蛋白硫氢化修饰位点为：Cys138/141。 6.FXR蛋白硫氢化修饰在缓解非酒精性脂肪肝生物制药中的应用。 7.H2S通过激活FXR抑制下游糖代谢及脂代谢靶基因表达在缓解非酒精性脂肪肝生物制药中的应用。
所属类别：	发明专利