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原文传递一种去泛素化酶的活性检测方法

专利名称：	一种去泛素化酶的活性检测方法
摘要：	本发明公开了一种去泛素化酶的活性检测方法，包括以下步骤：S1、将去泛素化酶，底物和反应缓冲液置于冰上解冻，将荧光素检测试剂置于室温，避光；S2、配制含有10mM DTT的1X反应缓冲液，并以含有10mM DTT的1X反应缓冲液分别配制去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液；与传统荧光分析法相比，本发明中的化学发光方法表现出更宽的线性范围，更高的灵敏度和更低的检测限，因此能获得更高可靠性的检测数据；在获得同等结果的前提下，通过氨基荧光素标记泛素(Ub‑AML)作为发光底物所需要的酶量，低于传统荧光法所需酶量几百甚至几千倍，从而极大的降低了高通量药物筛选的成本。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	苏州新格诺康生物技术有限公司
发明人：	姚晓晖;苏妙贤;来棽棽;谢志伟;严俊
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910806260.0
公开号：	CN110412004A
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	215000 江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园A7楼203室
主权项：	1.一种去泛素化酶的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、将去泛素化酶，底物和反应缓冲液置于冰上解冻，将荧光素检测试剂置于室温，避光； S2、配制含有10mM DTT的1X反应缓冲液，并以含有10mM DTT的1X反应缓冲液分别配制去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液； S3、在白色96孔板中，加入以下体积组分以获得20ul的总反应体积的混合液：a-10ul1X反应缓冲液；b-5ul去泛素化酶工作溶液；c-5ul底物工作溶液； S4、将白色96孔板稍作离心使各组分溶液聚集到孔底充分混匀，将S3所得混合液反应置于室温孵育25-35分钟； S5、在白色96孔板每孔中加入20ul荧光素检测试剂，然后将白色96孔板置于摇床上摇晃2分钟,之后将白色96孔板置于室温继续孵育30分钟； S6、读盘，记录每孔的发光值。 2.根据权利要求1所述的一种去泛素化酶的活性检测方法，其特征在于：所述底物为氨基荧光素标记泛素(Ub-AML)，且所述底物浓度为0.6uM。 3.根据权利要求1所述的一种去泛素化酶的活性检测方法，其特征在于：所述S2中含有10mM DTT的1X反应缓冲液是在S1中解冻后的反应缓冲液的基础上进行稀释得到。 4.根据权利要求1所述的一种去泛素化酶的活性检测方法，其特征在于：所述去泛素化酶包括半胱氨酸和金属蛋白酶类别的所有六个去泛素化酶家族。 5.根据权利要求1所述的一种去泛素化酶的活性检测方法，其特征在于：所述S2中去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液均通过将含有10mM DTT的1X反应缓冲液分别倒入盛有去泛素化酶与底物的玻璃器皿中制得。
所属类别：	发明专利