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原文传递一种基于免疫印迹法分析丝织品文物模拟样仿真度的方法

专利名称：	一种基于免疫印迹法分析丝织品文物模拟样仿真度的方法
摘要：	本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种基于免疫印迹法分析丝织品文物模拟样仿真度的方法，本发明先制备不同的丝织品文物模拟样，由于不同的碱老化时间对蚕丝的影响尚未可知，因此本发明在对各组丝织品文物模拟样进行免疫学检测(蛋白质印迹法)，探究碱老化对蚕丝结构的影响和免疫学检测的影响，并最终筛选出仿真度最高的样品。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江理工大学
发明人：	王秉;郑浩然;欧阳毅;胡铭周;彭志勤;万军民
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910793010.8
公开号：	CN110412297A
代理机构：	杭州永航联科专利代理有限公司
代理人：	侯兰玉
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310018 浙江省杭州市钱塘新区下沙高教西区2号大街928号浙江理工大学
主权项：	1.一种基于免疫印迹法分析丝织品文物模拟样仿真度的方法，其特征在于包括如下步骤： 1)将桑蚕丝浸泡在碳酸钠脱胶液中，加热并不断搅拌20-40min，重复此操作多次； 2)待丝胶被充分脱去后，将不溶的丝素用蒸馏水冲洗多次，然后置于50-70℃下干燥，然后将所得丝素分为多组，分别按浴比1∶90-110g/mL加入至氢氧化钠溶液中在35-40℃下碱老化不同时间； 3)碱老化后进行抽滤，将所得丝素置于35-40℃下干燥，每组丝素分别按浴比1∶40-60g/mL加入至蛋白提取液中，在95-100℃水浴中加热搅拌1.5-2.5h，然后将溶解有丝素蛋白的蛋白提取液进行透析； 4)将步骤3)所得蛋白提取液过滤，冷冻干燥，1-3天后研磨成粉，得到丝素蛋白粉末； 5)用蒸馏水清洗制胶架，在55-65℃下干燥10-20min后取出，搭好制胶架后，检查是否漏水，如不漏水则进行后续制胶操作，制得中间包夹有若干泳道的两块玻璃板； 6)将各组丝素蛋白粉末分别溶解于CB液中制得浓度为8-12mg/mL的丝素蛋白混合液，然后各取2.5-3.5ul的还原型5XSDS上样缓冲液于试管中，然后分别加入各组丝素蛋白混合液，在95-100℃水浴中加热8-12min，离心处理； 7)取上清液进行电泳操作，在第一个泳道内加入未染marker为分子量标志物，然后依次加入各组上清液进行电泳，电泳完成后将玻璃板之间的胶剥离并用蒸馏水清洗3到4次，清洗后通过化学发光成像仪观察电泳结果； 8)观察后，裁剪一个PVDF膜，将其浸泡于甲醇中0.5-1.5min激发，然后将PVDF膜和海绵滤纸浸泡至转移缓冲液中，进行三明治结构的搭建，然后进行转印，转印过程中用冰袋包裹于反应装置四周，转印电流为190-210mA，转印过程持续20-40min； 9)将18-22mL封闭液倒在PVDF膜上，摇床封闭0.5-1.5h后倒掉，加入8-12mL用TBST稀释好的一抗，一抗摇床孵育0.5-1.5h，然后用TBST清洗多次，每次用量18-22mL，摇床8-12min，清洗多次后，再加入8-12mL稀释后的二抗并孵育0.5-1.5h，孵育完成后用TBST清洗多次，最后将显色液均匀滴加在PVDF膜上，用锡箔纸包住避光3-7min，通过化学发光成像仪观察免疫结果，与真实丝织品文物样的结果进行对比，与真实丝织品文物样越接近则仿真度越高。 2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中，桑蚕丝与碳酸钠脱胶液的浴比为1∶90-110g/mL，加热温度为95-100℃。 3.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)中，透析所用透析袋的规格为截留分子量为2000，透析过程持续2-4天，并每隔2-4h换一次水。 4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5)中，制胶操作具体为：将分离胶用移液枪注射入两块玻璃板之间，然后取异丙醇注入至玻璃板间使其液面齐平；然后将玻璃板置于35-40℃下15-20min；待分离胶凝固后，将异丙醇倒掉，然后再加入浓缩胶并立即插上梳子，再次将装置将玻璃板置于35-40℃下10-20min，将制胶后的玻璃板放入电泳槽中进行检漏操作；放置时要短的玻璃板朝里，长的玻璃板朝外；然后拨去梳子形成泳道。 5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤7)中，电泳操作过程为：调节电压到75-85V，电泳8-12min后将电压升至110-130V，等待溴酚蓝到达底部附近时，停止电泳。 6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤9)中，一抗的抗原分别为桑蚕丝结晶区的特征肽段GAGAGSGAGAGS和无定形区的特征肽段MQRKNKNHGILGK；将上述两种特征肽段作为半抗原，和载体蛋白结合后进行动物免疫，得到两种抗丝素蛋白序列抗体。
所属类别：	发明专利