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原文传递一种双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法

专利名称：	一种双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法
摘要：	本发明涉及一种双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，所述方法包括Cu2+对邻苯二胺OPD的催化氧化步骤和食源性致病菌对Cu2+的催化还原步骤。本方法利用致病菌将Cu2+还原而改变传感体系的颜色和荧光强度的变化，进行双信号输出快速检测，通过双通道信号的输出，可较大程度上减低环境因素和人为因素的干扰，确保传感器在实际应用中的可靠性，增加检测结果的可靠性，同时具有操作简单、成本低、可视化和无需生物识别元件等的优势。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	天津;12
申请人：	天津科技大学
发明人：	刘亚青;王成男;高霞;王硕
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910566274.X
公开号：	CN110411993A
代理机构：	天津盛理知识产权代理有限公司
代理人：	韩晓梅
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	300457 天津市滨海新区经济技术开发区第十三大街9号
主权项：	1.一种双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：所述方法包括Cu2+对邻苯二胺OPD的催化氧化步骤和食源性致病菌对Cu2+的催化还原步骤。 2.根据权利要求1所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：所述催化氧化步骤为：Cu2+催化氧化OPD产生其氧化产物OPDox，在紫外灯下和自然光下呈现肉眼可见的橘黄色荧光和淡黄色自然色，产生荧光和紫外双通道信号；所述催化还原反应为：食源性致病菌利用自身的铜结合系统和氧化还原酶级联反应将Cu2+还原为Cu+，使其失去氧化OPD的能力，产生较少的OPDox，得到较低的荧光紫外双通道信号；所述荧光紫外双通道信号的降低与食源性致病菌的浓度呈线性相关，能够实现对食源性致病菌的快速精准检测。 3.根据权利要求2所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：所述显色、发光孵育时间为90min-120min。 4.根据权利要求1所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：所述食源性致病菌为具有铜离子酶级联系统的致病菌。 5.根据权利要求1所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：所述食源性致病菌为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌或结核分枝杆菌。 6.根据权利要求1至5任一项所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：具体步骤如下： ⑴食源性致病菌的菌体培养； ⑵向Cu2+与OPD的混合溶液中加入不同浓度的致病菌，所述致病菌的浓度在10-107CFU/mL之间，且分布合理，37℃孵育后，用荧光分光光度仪和紫外可见分光光度仪分别检测溶液的荧光光谱和紫外吸收光谱； ⑶分别以步骤⑵的荧光峰值和紫外峰值为纵坐标，以致病菌的浓度为横坐标，得到检测数据，对检测数据进行线性拟合得到相关线性回归方程后，利用线性回归方程实现对未知致病菌浓度的检测。 7.根据权利要求6所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：所述步骤⑵中使用的不同浓度的致病菌为在指数生长期收获的致病菌。 8.根据权利要求6所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：所述步骤⑵中Cu2+的终浓度为4-10μM，OPD的终浓度为1.5-2.5mM，混合溶液的pH在6.5-7.5之间。 9.根据权利要求6所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：所述步骤⑵中混合溶液配置在水中或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液中；或者，所述孵育时间在0-30min之间；所述荧光光谱的激发波长在410nm-420nm，发射波长检测范围在500nm-700nm之间，峰值在563nm；所述紫外吸收光谱的记录范围在300nm-550nm，峰值在417nm。 10.根据权利要求1至4任一项所述的双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法，其特征在于：具体步骤如下： ⑴将活化完全的大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃培养6-8h后，以转速3000-6000rpm/min离心5min收获菌体，将沉淀分散在1mL Tris·HCl中；通过紫外可见分光光度计测量其波长600nm处的光密度OD值监测致病菌浓度，OD600＝0.6时大肠杆菌浓度为106CFU/mL； ⑵向Cu2+和OPD的Tris·HCl缓冲溶液中加入大肠杆菌，使其终浓度分散在10-107CFU/mL之间，其中所述Cu2+和OPD的终浓度范围分别可在4-10μM和1.5-2.5mM之间；对较大浓度的致病菌检测，采取倍比稀释法将菌悬液稀释至10-107CFU/mL浓度范围内，进行半定量分析； ⑶将上述溶液先于室温孵育0-30min，而后于37℃恒温孵育90-120min显色，最终用荧光分光光度仪和紫外可见分光光度仪检测传感体系的荧光光谱和紫外吸收光谱；其所述荧光光谱激发波长在410-420nm之间，发射波长范围在500nm-700nm之间，峰值在563nm；所述紫外吸收光谱的记录范围在300nm-550nm，吸收峰值在417nm； ⑷分别以传感体系荧光峰值强度和紫外峰值吸收值为纵坐标，以大肠杆菌浓度的对数值为横坐标，对检测数据进行线性拟合，得到相关线性回归方程，利用线性回归方程实现对未知大肠杆菌浓度的检测。
所属类别：	发明专利