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原文传递一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法及其应用

专利名称：	一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法及其应用
摘要：	本发明公开了一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）发光功能化Ru‑MOF的合成；（2）Ru‑MOF吸附Pb2+之后用来标记食源性致病菌的适体2作为信号单元Ru‑MOF@Pb2+‑Apt2；（3）在处理好的金电极上依次滴加Apt1、食源性致病菌目标物、信号单元Ru‑MOF@Pb2+‑Apt2，即制备得到双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器，该适体传感器可通过ECL和DPV法对未知的食源性致病菌浓度进行定量检测；优点是检测结果的相互佐证可以有效地避免假阳性的出现，达到精确检测食源性致病菌的目的，具有高灵敏度、简单、快速、易于操作和实验成本低。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	宁波大学
发明人：	郭智勇;邵慧丽;郝婷婷;王邃;胡宇芳;晁多斌;黄又举;康维钧
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910183464.3
公开号：	CN110006971A
代理机构：	宁波奥圣专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	何仲
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	315211 浙江省宁波市江北区风华路818号
主权项：	1.一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）发光功能化Ru-MOF的合成将18 mg的[Ru(dcbpy)3]2+溶解在10 mL的正丙醇和去离子水的混合溶液中；然后，将54mg的Zn(NO3)2溶解在以上制备的溶液中并超声处理1小时后，在室温下反应24小时，于8000rpm，4℃温度下离心5 min获得所得的复合物，并用去离子水洗涤三次得到发光功能化Ru-MOF纳米颗粒产物，最后将产物分散在去离子水中；其中正丙醇和去离子水混合溶液中正丙醇和去离子水体积比为3：1；（2）信号单元Ru-MOF@Pb2+-Apt2的合成将1.5 mL 2.0 mg/mL Ru-MOF纳米颗粒分散在3 mL 10 mM Pb(NO3)2溶液中，并在室温下反应24小时，于12000 rpm离心5分钟后，将得到的沉淀用去离子水洗涤三次得到Ru-MOF@Pb2+复合物，然后取200 μL 100 μg/mL Ru-MOF@Pb2+复合物和400 μL EDC/NHS复合物于玻璃瓶中，混合均匀后，采用1.0 mol/L HCl溶液调溶液pH为5，震荡孵育1 h，于8000 r离心15min，去离子水洗涤3次；向玻璃瓶内加入50 μL 10 µmol/L的第二适体Apt2，混合均匀后采用1.0 mol/L NaOH溶液调溶液pH为9，震荡孵育4小时，于8000 rpm离心15 min，去离子水洗三次，洗涤至中性，取出上清液，将沉淀分散在50 μL DNA杂交缓冲溶液中即得到信号单元Ru-MOF@Pb2+-Apt2溶液；（3）双通道适配体传感器的制备 A．将直径为3 mm的金电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，用水冲洗干净，再依次在乙醇、水中超声洗涤，清洗后的电极放入由浓H2SO4和H2O2按体积比7：3混合成的混合溶液中浸泡5～10 min，取出洗净，然后在0.5 mol/L硫酸溶液中用循环伏安扫描处理，扫描速度为50 mV/s，电压范围为0～1.6 V，持续扫描得到稳定的循环伏安图后，取出用水洗净待用； B．在上述处理好的金电极上滴入10 μL 第一适体Apt1，于37℃条件下孵育16 h，随后加入10μL 2 mM 6-巯基-1-己醇，以封闭金电极表面非特异性活性位点，37℃条件下继续孵育1 h，用去离子水洗涤，洗掉未结合的6-巯基-1-己醇；接着将10 μL 食源性致病菌目标物溶液滴涂在上述修饰有Apt1的金电极上，37℃条件下扣帽孵育1 h，使Apt1和食源性致病菌充分反应，随后用去离子水充分洗涤除去多余的食源性致病菌；向反应区域滴加10 µL 上述步骤（2）制备的信号单元Ru-MOF@Pb2+-Apt2溶液，在37℃条件下静置60 min，利用食源性致病菌和Apt2的特异性结合，将Ru-MOF@Pb2+引入到整个传感器中分别作为电化学发光和电化学的信号物，反应完成后用去离子水洗涤2～3次，即制备得到双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器。 2.根据权利要求1所述的一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法，其特征在于：所述的食源性致病菌包括副溶血弧菌、肠沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。 3.根据权利要求2所述的一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法，其特征在于：所述的副溶血弧菌的第一适体Apt1的序列为：5′-SH-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3′，第二适体Apt2的序列为5′-NH2-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3′。 4.根据权利要求2所述的一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法，其特征在于：所述的沙门氏菌第一适体Apt1的序列为：5′- SH-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3′，第二适体Apt2的序列为5′- NH2-SH-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3′。 5.根据权利要求2所述的一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法，其特征在于：所述的金黄色葡萄球菌第一适体Apt1的序列为：5'-SH-TCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATC CCACAGCTACGTC- 3'，第二适体Apt2的序列为：5'- NH2-TCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATC CCACAGCTACGTC- 3。 6.根据权利要求2所述的一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的EDC/NHS复合物中EDC浓度为100 mg/mL、NHS浓度为10mg/mL。 7.一种利用权利要求1-6中任一项所述的双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）ECL法检测食源性致病菌：将制备好的双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，组成三电极体系放在电化学发光测试中进行测试，根据食源性致病菌不同浓度下对应的电化学发光强度值得到电化学发光法的工作曲线，从而对待测溶液中食源性致病菌浓度进行定量检测；（2）DPV法检测食源性致病菌：DPV的测试液为pH=4.5的HAc-NaAc缓冲溶液，电压范围0.3V～0.8V，扫速为0.1 V/s，根据食源性致病菌不同浓度下的电流值得到差分脉冲伏安法的工作曲线，从而对待测溶液中食源性致病菌浓度进行定量检测。 8.根据权利要求7所述的双通道输出检测食源性致病菌的方法，其特征在于：步骤（1）中电化学发光测试采用计时电流法作为激发信号，电压范围0～1.5V，脉冲宽度为0.25s，脉冲周期为30s，高压值800V。
所属类别：	发明专利