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原文传递一种注射用重组人尿激酶原杂质分析的梯度电泳检测方法

专利名称：	一种注射用重组人尿激酶原杂质分析的梯度电泳检测方法
摘要：	本发明涉及一种注射用重组人尿激酶原杂质分析的梯度电泳检测方法，尤其是注射用重组人尿激酶原降解物(降解产物大约为20kDa～36kDa)和多聚体(二聚体大约为100KDa～140KDa)，中间体及其降解物，本发明所述方法采用梯度凝胶电泳检测方法，其检测条件是所用梯度胶为聚丙烯酰胺凝胶，电泳时所用的缓冲液为MOPS缓冲液，其中，所述梯度胶为含4‑12％Nupage分布的聚丙烯酰胺凝胶或含4‑20％Surepage分布的聚丙烯酰胺凝胶，所述MOPS缓冲液为1×MOPS缓冲液。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	天士力生物医药股份有限公司
发明人：	莫英;韩进;吴卫娟
专利状态：	有效
申请日期：	2018-05-07T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201810426464.7
公开号：	CN110455903A
代理机构：	北京华科联合专利事务所(普通合伙)
代理人：	王为
分类号：	G01N27/447(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	中国(上海)自由贸易试验区居里路280号1、2幢
主权项：	1.一种注射用重组人尿激酶原杂质检测方法，其特征在于，所述方法采用梯度凝胶电泳检测方法，其检测条件是所用梯度胶为聚丙烯酰胺凝胶，电泳时所用的缓冲液为MOPS缓冲液。 2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度胶为含4-12％Nupage分布的聚丙烯酰胺凝胶或含4-20％Surepage分布的聚丙烯酰胺凝胶。 3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述MOPS缓冲液为1×MOPS缓冲液；或所述MOPS缓冲液采用市售5×MOPS缓冲液，然后加入1：4的MilliQ注射用水稀释得到；配置方法为：MOPS 10.3g，加50mM NaAc 400ml，用2M NaOH调pH至7.0，再加入0.5M EDTA 10ml，加DEPC H2O至500ml，无菌抽滤，室温避光保存；或市售20×MOPS缓冲液，用MilliQ注射用水稀释。 4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，电泳时的仪器电压为120-200V，优选为140-180V。 5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)供试品溶液的制备：取注射用重组人尿激酶原置于冰上融化，MilliQ注射用水稀释至10-30μg/10-30μl，加入非还原样品缓冲液后，使得重组人尿激酶原的浓度为10-30μg/15-35μl，然后置于50-70℃加热1-5分钟后，立即置于冰浴中得供试品溶液； (2)Marker溶液的制备：取Marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分钟，立即置冰浴备用； (3)测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，对供试品溶液和Marker溶液进行检测，选择Nupage(4％～12％)或Surepage(4％～20％)聚丙烯酰胺凝胶，两种溶液的上样量为10-20μl，仪器电压120-200V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度。 6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：其中，步骤(1)中：非还原样品缓冲液为三羟基氨基甲烷0.3份、十二烷基硫酸钠0.8份、溴酚蓝0.002份、丙三醇4份、盐酸0.2份，加MilliQ注射用水溶解并定容至10份即得。 7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：其中，步骤(2)中： Marker为分子量为5KD-270KD的Marker，优选为5-180KD，进一步优选为5-150KD。 8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：其中，步骤(3)中： MOPS，即3-(N-玛啉基)丙磺酸，分子式为C7H15NO4S，分子量209.26，CAS登记号1132-61-2，MOPS属于生物缓冲剂；上样前供试品溶液和Marker溶液，过滤或离心后，冷冻待上样。 9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)供试品溶液的制备：取待测样品置冰上，待样品融化后，根据样品的重组人尿激酶原含量，用MilliQ注射用水稀释至蛋白含量15-25μg/15μl，加入非还原样品缓冲液，使蛋白含量为15-25μg/20μl，然后在50-70℃条件下处理3分钟，立即置于冰浴中，即得供试品溶液； (2)Marker溶液的制备：取Marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分钟，立即置冰浴备用； (3)测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，供试品溶液和Marker溶液进行上样，供试品溶液和Marker溶液在上样前需要进行离心，离心条件为8000rmp/min，离心1min后置冰上冷冻，对选择Nupage(4％～12％)或Surepage(4％～20％)聚丙烯酰胺凝胶，两种溶液的上样量为10-20μl，仪器电压140-180V，梯度胶为含4-12％Nupage分布的聚丙烯酰胺凝胶或含4-20％Surepage分布的聚丙烯酰胺凝胶，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度。
所属类别：	发明专利