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原文传递一种生物土壤结皮多糖的检测方法

专利名称：	一种生物土壤结皮多糖的检测方法
摘要：	本发明提供一种生物土壤结皮多糖的检测方法，该检测方法，一方面，采用水提醇沉法对生物土壤结皮胞外多糖进行提取，提取方法经济快捷，设备简单，多糖产率高，另一方面，同时采用糖腈乙酸酯衍生化和三甲基硅烷衍生化方法对提取后水解的多糖进行衍生化处理，可检测不同种类的单糖，确保了检测的全面性，另外，采用气相色谱‑质谱分析法和内标法对衍生化处理后单糖组分进行定性定量分析，三者共同作用，使得采用本发明的生物土壤结皮多糖的检测方法对多糖进行检测具有较高的灵敏度和精确度，同时，本发明检测方法易于实现，从而使得本发明易于推广和应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉理工大学
发明人：	吴丽;叶兴旺;钱隆;林思萌;杨列;张祖麟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-31T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910700303.7
公开号：	CN110441418A
代理机构：	湖北武汉永嘉专利代理有限公司
代理人：	崔友明
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	430070湖北省武汉市洪山区珞狮路122号
主权项：	1.一种生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)采用水提醇沉法提取待测生物土壤结皮中的多糖； 2)将所述多糖与酸溶液混合后，水浴加热，进行水解反应，待所述水解反应结束后，将水解反应得到的水解液用氮气吹干，得到单糖组分； 3)采用糖腈乙酸酯衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分A； 4)采用三甲基硅烷衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分B； 5)将所述单糖离子化组分A和所述单糖离子化组分B用有机溶剂稀释后，采用气相色谱-质谱分析法和内标法对所述单糖离子化组分A和所述单糖离子化组分B进行定性定量分析。 2.根据权利要求1所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中采用水提醇沉法提取待测生物土壤结皮中的多糖，包括：将待测生物土壤结皮研磨、过筛后，水浴离心，然后，加入乙醇并加热脱脂，随后，用乙醇洗脱，再用水浴提取法提取，得到粗多糖提取液；将所述粗多糖提取液抽滤浓缩后，加入乙醇，醇沉粗多糖，待粗多糖醇沉结束后，离心，得到粗多糖沉淀；采用Sevag法除去所述粗多糖沉淀中的蛋白，然后，透析，冷冻干燥，得到待测生物土壤结皮中的多糖。 3.根据权利要求2所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述水浴离心，包括：在40℃水浴下振荡2h后，以8000r/min的转速离心，去除上清液；所述加入乙醇并加热脱脂，包括：加入80％乙醇并在80℃下冷凝回流6h；所述水浴提取法提取，包括：按照90∶1的水料比，在80℃水浴下，提取3次，每次提取4h；所述加入乙醇，醇沉粗多糖，包括：加入所述粗多糖提取液四倍体积的95％乙醇，醇沉粗多糖；所述Sevag法中Sevag试剂包括三氯甲烷和正丁醇，且所述三氯甲烷和所述正丁醇的体积比为3∶1，所述Sevag试剂与所述粗多糖提取液的体积比为1∶3。 4.根据权利要求1所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中所述酸溶液为三氟乙酸，且所述酸溶液的浓度为2-4mol/l；所述步骤2)中所述水浴加热的加热温度为90-120℃，加热时间为2-4h；所述步骤2)中所述氮气吹干的吹干温度为70℃，氮气进气量为0.5ml/min。 5.根据权利要求1所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中采用糖腈乙酸酯衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分A，包括：向所述单糖组分中加入盐酸羟胺、肌醇和吡啶，然后，进行第一次水浴加热，待所述第一次水浴加热结束后，加入乙酸酐，进行第二次水浴加热，待所述第二次水浴加热结束后，将所述第二次水浴加热得到的反应物用氮气吹干，得到单糖离子化组分A。 6.根据权利要求5所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述第一次水浴加热的加热温度为80-110℃，加热时间为1-2h；所述第二次水浴加热的加热温度为80-110℃，加热时间为2-3h。 7.根据权利要求1所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中采用三甲基硅烷衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分B，包括：向所述单糖组分中加入肌醇、吡啶、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷，然后，水浴加热，待所述水浴加热结束后，将所述水浴加热得到的反应物用氮气吹干，得到单糖离子化组分B。 8.根据权利要求7所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述水浴加热的加热温度为80℃，加热时间为20min。 9.根据权利要求1所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤5)中将所述单糖离子化组分A和所述单糖离子化组分B用有机溶剂稀释后，采用气相色谱-质谱分析法和内标法对所述单糖离子化组分A和所述单糖离子化组分B进行定性定量分析，包括：所述单糖离子化组分A标准曲线的制作：称取鼠李糖标准品、阿拉伯糖标准品、岩藻糖标准品、木糖标准品、甘露糖标准品、葡萄糖标准品、半乳糖标准品各0.5-1.0mg、1.0-1.5mg、1.5-2.0mg、2.0-2.5mg，并加入内标物，然后，用糖腈乙酸酯衍生化方法衍生化处理，以内标物与单糖峰面积之比为纵坐标，以内标物与单糖质量之比为横坐标制作单糖离子化组分A标准曲线；所述单糖离子化组分B标准曲线的制作：称取果糖标准品、葡萄糖醛酸标准品、半乳糖醛酸标准品各0.5-1.0mg、1.0-1.5mg、1.5-2.0mg、2.0-2.5mg，并加入内标物，然后，用三甲基硅烷衍生化方法衍生化处理，以内标物与单糖峰面积之比为纵坐标，以内标物与单糖质量之比为横坐标制作单糖离子化组分B标准曲线；单糖离子化组分A待测液的制备：向所述单糖离子化组分A中加入三氯甲烷溶解，并将溶解液稀释、过滤，得到单糖离子化组分A待测液；单糖离子化组分B待测液的制备：向所述单糖离子化组分B中加入正己烷溶解，并将溶解液稀释、过滤，得到单糖离子化组分B待测液；单糖组分的测定：采用气相色谱-质谱分析法对所述单糖离子化组分A待测液和所述单糖离子化组分B待测液进行单糖组分测定，并将所述单糖离子化组分A待测液和所述单糖离子化组分B待测液的测定结果与相对应的所述单糖离子化组分A标准曲线和所述单糖离子化组分B标准曲线进行比对，以对所述单糖离子化组分A和所述单糖离子化组分B进行定性定量分析。 10.根据权利要求9所述的生物土壤结皮多糖的检测方法，其特征在于，所述采用气相色谱-质谱分析法对所述单糖离子化组分A待测液进行单糖组分测定中的检测条件为：载气：99.9％氦气；体积流量：1ml/min；分流比：30∶1；进样口温度：220℃；程序升温梯度：起始温度为100℃，以10℃/min的速度升至160℃，保持2min，以5℃/min的速度升至170℃，保持1min，以1℃/min的速度升至180℃，保持1min，以1℃/min的速度升至185℃，保持1min，以1℃/min的速度升至190℃，保持1min，以10℃/min的速度升至220℃，保持5min；离子源温度：230℃；前进样口温度：250℃；所述采用气相色谱-质谱分析法对所述单糖离子化组分B待测液进行单糖组分测定中的检测条件为：体积流量：1mL/min；分流比：20∶1；进样量：1uL；溶剂延迟时间：5min；进样口温度：250℃；传输管路温度：250℃；梯度升温程序：起始温度为80℃，保持3min，以10℃/min的速度升至250℃，保持10min；所述气相色谱-质谱分析法中质谱分析条件为：溶剂延迟：7min；EI能量：70eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃。
所属类别：	发明专利