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原文传递一种蛋白的非还原肽图分析方法

专利名称：	一种蛋白的非还原肽图分析方法
摘要：	本发明提供一种蛋白的非还原肽图分析方法，该方法首先利用变性剂对蛋白进行变性处理，然后酶解，酸终止反应后通过反向高效液相色谱进行检测。本发明的非还原肽图分析方法使得蛋白在酶解时更彻底，反向高效液相色谱检测中色谱峰均匀分布，出峰数目多，分离度好，且色谱图基线平稳，能够最真实反应蛋白酶解后的各肽段情况，对蛋白的质量控制具有重要意义。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	四川;51
申请人：	成都康弘生物科技有限公司
发明人：	柯潇;唐懿挺;罗祖秀
专利状态：	有效
申请日期：	2018-06-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201810632993.2
公开号：	CN110618229A
分类号：	G01N30/89(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	610036 四川省成都市金牛区蜀西路36号
主权项：	1.一种蛋白的非还原肽图分析方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)样品处理：将蛋白加入变性试剂进行变性后，加入胰蛋白酶进行酶解，然后酸终止酶解反应； 2)反向高效液相色谱检测：对终止酶解后的样品进行反向高效液相色谱检测，检测条件为：色谱柱：反向十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：0.07-0.1％三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为10-30％；柱温：30-60℃；检测波长：214nm；梯度洗脱。 2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述梯度洗脱程序为： 3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述变性试剂为RapiGest SF或盐酸胍，优选RapiGest SF；RapiGest SF浓度优选为0.1-0.2w/v％，更优选0.2w/v％；所述胰蛋白酶为甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理的胰蛋白酶、测序级胰蛋白酶或质谱级胰蛋白酶，优选测序级胰酶；胰蛋白酶浓度相对于蛋白质量比为25:1～50:1，优选50:1。 4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述酸为醋酸或三氟乙酸；醋酸的浓度为50％，三氟乙酸浓度为0.1％。 5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述反向高效液相色谱检测方法中，流动相B为0.085％三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为20％；流速为1ml/min；柱温为60℃。 6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的样品处理步骤中，将蛋白加入变性试剂进行变性的步骤为：取一定量的蛋白，用超纯水超滤换液三次，之后加入RapiGestSF并混匀，将混合液于沸水浴中放置，然后取出并冷却至室温。 7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的样品处理中，加入胰蛋白酶进行酶解的步骤为：在变性后的混合液中加入碳酸氢钠和测序级胰蛋白酶，混匀后37℃水浴反应。 8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的样品处理步骤为： 1)取蛋白样品一定量，用超纯水超滤换液三次；收集超滤后蛋白溶液，加入0.2w/v％RapiGest SF并混匀，将混合液于沸水浴中放置10min，之后取出并冷却至室温； 2)加入0.5M碳酸氢铵溶液和0.1mg/ml测序级胰蛋白酶，混匀后37℃水浴16h～18h，偶尔取出轻摇； 3)37℃水浴完毕后，加入50％醋酸溶液，离心，取上清液待测。 9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于反向高效液相色谱检测条件为：色谱柱：反向十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：0.085％三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为20％；流速：1ml/min，柱温60℃；检测波长：214nm；梯度洗脱程序为： 10.根据权利要求1-9中任一项所述的分析方法，其特征在于所述的蛋白为序列1。
所属类别：	发明专利