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原文传递一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法

专利名称：	一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法
摘要：	本发明提供了一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法。所述测试方法包括如下步骤：在液相环境中用蛋白变性液和二硫键还原剂对雷莫芦单抗样品进行变性还原处理；加入烷基化试剂，进行烷基化反应，用二巯基苏糖醇终止反应；进行脱盐，然后加入胰蛋白酶进行酶解，用有机酸终止酶解反应并酸化肽段；用超高效液相色谱进行检测，得到所述雷莫芦单抗的肽图。本发明提供的测试方法简单易行，90min即可完成测试，得到的肽图的各峰的分离度高，准确度高，方法的重复性好，稳定可行。
专利类型：	发明专利
申请人：	上海博威生物医药有限公司
发明人：	王少雄;吕品;陈鹏
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T17:00:00+0805
申请号：	CN201911423878.5
公开号：	CN111024863A
代理机构：	北京品源专利代理有限公司
代理人：	巩克栋
分类号：	G01N30/02;G01N30/34;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/74;G01N30/86;G01N30/88;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/34;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/74;G01N30/86;G01N30/88
申请人地址：	201318 上海市浦东新区周浦镇蓝靛路1199号2幢301室
主权项：	1.一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法，其特征在于，所述测试方法包括如下步骤： (1)在液相环境中用蛋白变性液和二硫键还原剂对雷莫芦单抗样品进行变性还原处理； (2)在步骤(1)得到的溶液中加入烷基化试剂，进行烷基化反应，用二巯基苏糖醇终止反应； (3)对步骤(2)得到的溶液进行脱盐，然后加入胰蛋白酶进行酶解，用有机酸终止酶解反应并酸化肽段； (4)用超高效液相色谱对步骤(3)处理后的样品进行检测，得到所述雷莫芦单抗的肽图。 2.根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于，步骤(1)中所述蛋白变性液中含有盐酸胍；优选地，步骤(1)所述液相环境中盐酸胍的浓度为5.5-6.5M，进一步优选为6M；优选地，步骤(1)中所述二硫键还原剂为二巯基苏糖醇；优选地，步骤(1)所述液相环境中二巯基苏糖醇的浓度为40-60mM，进一步优选为50mM。 3.根据权利要求1或2所述的测试方法，其特征在于，步骤(1)中所述变性还原处理的温度为35-40℃，进一步优选为37℃；优选地，步骤(1)中所述变性还原处理的时间为1-3h，进一步优选为1h。 4.根据权利要求1-3任一项所述的测试方法，其特征在于，步骤(2)中所述烷基化试剂为碘乙酸；优选地，步骤(2)中所述烷基化试剂的添加量为100-140mM，进一步优选为120mM；优选地，步骤(2)中所述烷基化反应是在避光条件下进行；优选地，步骤(2)中所述烷基化反应的温度为18-25℃，进一步优选为22℃；优选地，步骤(2)中所述烷基化反应的时间为40-60min，进一步优选为45min；优选地，步骤(2)中所述二巯基苏糖醇的添加量为30-50mM，进一步优选为40mM。 5.根据权利要求1-4任一项所述的测试方法，其特征在于，步骤(3)中所述脱盐的方法为超滤管离心脱盐或脱盐柱脱盐；优选地，在步骤(3)中所述脱盐之后，还进行如下操作：用微量紫外分光光度计检测脱盐后的溶液中的雷莫芦单抗浓度；优选地，步骤(3)中所述胰蛋白酶与脱盐后的溶液中的雷莫芦单抗的质量比为1:(12.5-50)，进一步优选为1:25。 6.根据权利要求1-5任一项所述的测试方法，其特征在于，步骤(3)中所述酶解的温度为35-40℃，进一步优选为37℃；优选地，步骤(3)中所述酶解的时间为1-4h，进一步优选为2h；优选地，步骤(3)中所述有机酸为甲酸；优选地，步骤(3)中所述有机酸的添加量为0.1-0.2Vol％，进一步优选为0.1Vol％。 7.根据权利要求1-6任一项所述的测试方法，其特征在于，步骤(4)中所述超高效液相色谱采用的色谱柱的固定相为C18；优选地，所述超高效液相色谱采用的色谱柱的温度为47-53℃，进一步优选为50℃；优选地，所述超高效液相色谱的检测波长为210-220nm，进一步优选为214nm。 8.根据权利要求1-7任一项所述的测试方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的流动相为含有三氟乙酸和甲酸的水-乙腈混合溶液；优选地，所述流动相的流速为0.25-0.35mL/min，进一步优选为0.3mL/min。 9.根据权利要求1-8任一项所述的测试方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用流动相进行梯度洗脱；优选地，所述梯度洗脱使用的流动相中乙腈的浓度随洗脱时间先增大后增减小；优选地，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-5min：97-99％流动相A和1-3％流动相B；5-65min：93-95％流动相A和5-7％流动相B；65-70min：60-68％流动相A和32-40％流动相B；70-78min：35-45％流动相A和55-65％流动相B；78-80min：17-23％流动相A和77-83％流动相B；80-90min：97-99％流动相A和1-3％流动相B；所述流动相A为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的水溶液；所述流动相B为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的乙腈溶液；优选地，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-5min：98％流动相A和2％流动相B；5-65min：94％流动相A和6％流动相B；65-70min：64％流动相A和36％流动相B；70-78min：40％流动相A和60％流动相B；78-80min：20％流动相A和80％流动相B；80-90min：98％流动相A和2％流动相B；所述流动相A为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的水溶液；所述流动相B为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的乙腈溶液。 10.根据权利要求1-9任一项所述的测试方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的进样体积为8-15μL，进一步优选为10μL。
所属类别：	发明专利