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高效筛选农杆菌介导基因编辑中非转基因突变体的方法
| 专利名称： | 高效筛选农杆菌介导基因编辑中非转基因突变体的方法 |
| 摘要： | 本发明公开了一种高效筛选农杆菌介导基因编辑中非转基因突变体的方法，包括以下步骤：(1)在传统基因编辑载体上连入CaMV 35S promoter启动的GUS报告基因，将载体转入农杆菌EH105中；(2)将转入载体的所述农杆菌EH105用叶盘法侵染普通烟草叶片，将侵染后的叶片接种到含有乙酰丁香酮的MS固体培养基上，在25℃下、暗环境下共培养2d；(3)将共培养的外植体接种到不含筛选压的再生培养基上，每20天更换一次新鲜同样的再生培养基；(4)将再生的白化芽接种到含有Timentin的MS培养基上，待白化苗长至3～4片叶子时，取样进行GUS染色，不含GUS信号的白化苗即为候选非转基因突变体。本发明能快速去除转基因突变体并获得非转基因突变体，方法快捷简便，更简单化、实用化。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 江苏;32 |
| 申请人： | 江苏省农业科学院 |
| 发明人： | 陈龙正;刘静;宁宇 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 2019-08-22T00:00:00+0800 |
| 发布日期： | 2019-12-31T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201910777524.4 |
| 公开号： | CN110632157A |
| 代理机构： | 北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙) |
| 代理人： | 邢文月 |
| 分类号： | G01N27/447(2006.01);G;G01;G01N;G01N27 |
| 申请人地址： | 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街50号 |
| 主权项： | 1.一种高效筛选农杆菌介导基因编辑中非转基因突变体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1)在传统基因编辑载体上连入CaMV 35S promoter启动的GUS报告基因，将载体转入农杆菌EH105中； (2)将转入载体的所述农杆菌EH105用叶盘法侵染普通烟草叶片，将侵染后的叶片接种到含有乙酰丁香酮的MS固体培养基上，在25℃下、暗环境下共培养2d； (3)将共培养的外植体接种到不含筛选压的再生培养基上，每20天更换一次新鲜同样的再生培养基； (4)将再生的白化芽接种到含有Timentin的MS培养基上，待白化苗长至3～4片叶子时，取样进行GUS染色，不含GUS信号的白化苗即为候选非转基因突变体。 2.如权利要求1所述的高效筛选农杆菌介导基因编辑中非转基因突变体的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述在传统基因编辑载体上连入CaMV 35S promoter启动的GUS报告基因具体为：在Crispr-cas9-PDS载体的T-DNA上连入CaMV 35S promoter启动的GUS报告基因。 3.如权利要求1所述的高效筛选农杆菌介导基因编辑中非转基因突变体的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述侵染为用OD值＝0.6的EH105菌液侵染15min； 所述MS固体培养基中乙酰丁香酮的浓度为20mg·L-1。 4.如权利要求1所述的高效筛选农杆菌介导基因编辑中非转基因突变体的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述再生培养基为添加2.0mg·L-1的6-BA、0.1mg·L-1的NAA、100mg·L-1Timentin的不含筛选压的MS培养基。 5.如权利要求1所述的高效筛选农杆菌介导基因编辑中非转基因突变体的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述MS培养基中Timentin浓度为100mg·L-1。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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