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原文传递液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒

专利名称：	液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒
摘要：	本发明公开一液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒，取检测血清或检测血浆，加入甲氨喋呤内标定量，通过将游离维生素B12从维生素B12中游离出来，提供氰基离子，稳定钴胺素异构体为氰钴胺素；利用固相萃取法对维生素B12进行富集的步骤，并采用串联质谱检测进行人体血浆或血清内维生素B12的测定，特异性强，灵敏度高，可满足临床检测的需求。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州度安医学检验实验室有限公司
发明人：	高飞;海云;王万强
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-31T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910097240.0
公开号：	CN109709253A
代理机构：	无锡市汇诚永信专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	王闯
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	310026 浙江省杭州市余杭区五常街道向往街199号1幢2单元301、302、303、403室
主权项：	1.液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，测定血清或血浆中维生素B12，其特征在于，包括： (1)取检测血清或检测血浆，加入甲氨喋呤内标； (2)维生素B12的提取和稳定：维生素B12的提取：将结合态维生素B12从钴胺素结合蛋白中游离出来；维生素B12的稳定：提供氰基离子，转化钴胺素异构体(羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素)为相对稳定的氰钴胺素； (3)净化浓缩氰钴胺素：利用固相萃取法对维生素B12进行净化富集；以及 (4)串联质谱检测；其中色谱条件选择为：色谱柱：Kinetex 2.6μm Polar C18LC Column 50 x 2.1mm；流动相A液：含有甲酸的乙酸铵水溶液；流动相B液：含有甲酸的乙酸铵甲醇溶液：流速：0.3-0.4mL/min；进样量：20μL-40μL；柱温：30-40℃；其中质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；离子喷雾电压：4500-5500V；离子源温度：400-500℃；气帘气：20-35psi；碰撞气：9psi；离子源雾化气：40-55psi；离子源加热辅助气：40-60psi；扫描模式：MRM；对应维生素B12和内标的检测离子对及其他条件如下表： (4)定量检测：获取检测结果，代入维生素B12标准品回归方程得到血清或血浆中B12的含量，其中维生素B12标准品回归方程以标准溶液浓度为X轴，标准品和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析得到。 2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，其特征在于，所述色谱条件为：流速：0.4mL/min，柱温为35℃，进样20μL；等梯度洗脱,所述质谱条件为：离子喷雾电压：5500V；离子源温度：500℃；气帘气：20psi；碰撞气：9psi；离子源雾化气：55psi；离子源加热辅助气：60psi；扫描模式：MRM。 3.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，所述维生素B12的稳定步骤中，提供的氰基离子选择氰化钾或氰化钠或含氰基的络合物溶液。 4.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，其特征在于，选择通过HLB固相萃取柱除盐、净化、浓缩；条件控制为：活化平衡：500-1000μL甲醇活化，500-1000μL超纯水平衡。 5.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，其特征在于，所述维生素B12的提取选择以下三种方法之一：采用蛋白释放剂还原维生素B12结合蛋白中的二硫键，利用强碱破坏维生素B12和结合单元的氢键和组氨酸的配位键；在缓冲液中利用高温条件控制蛋白质变性；利用蛋白酶水解蛋白，将维生素B12从维生素B12结合蛋白中游离出来；其中所述蛋白释放剂选自二硫代苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的一种；所述缓冲液选自乙酸钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，蛋白变性的条件选择为：水浴100℃加热或121℃高压灭菌器；所述蛋白酶选自胰腺蛋白酶或木瓜蛋白酶。 6.根据权利要求5所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，其特征在于，量取1体积份的检测血清或检测血浆置于洁净离心管中；加入0.1体积份0.1μg/mL的甲氨喋呤，加入0.4-1体积份的氰化钾溶液，其中所述氰化钾溶液含浓度为1mg/mL的2％氢氧化钠，加入0.05体积份的二硫苏糖醇溶液，混匀3-5分钟，避光超声15-30分钟；加入1％-2％冰醋酸溶液中和样品，混匀2分钟，12000rpm/min离心5分钟，取上清液上样至活化平衡好的HLB固相萃取柱，待样品流出后，5％甲醇水洗杂，干燥1-2min，用甲醇分两次洗脱，氮吹，复溶，涡旋混匀5min，移取至96孔板，离心5min。 7.根据权利要求5所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，其特征在于，量取1体积份的检测血清或检测血浆置于洁净离心管中；0.1体积份0.1μg/mL的甲氨喋呤，加入4-6体积份内标的0.1M/L的pH为4.0-4.6之间的含一定浓度氰化钠的乙酸钠缓冲液，混匀3-5分钟，100℃水浴30分钟，放于冰浴冷却，12000rpm/min离心5分钟，取上清液上样至活化平衡好的HLB固相萃取柱，待样品流出后，待样品流出后，5％甲醇水洗杂，干燥1-2min，用甲醇分两次洗脱，氮吹，复溶，涡旋混匀5min，移取至96孔板，离心5min。 8.根据权利要求6-7任一所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，其特征在于，采用离心浓缩仪要换为50％甲醇水分两次洗脱，50％甲醇水洗脱要用离心浓缩仪浓缩至干后，复溶，涡旋混匀5min，移取至96孔板，离心5min。 9.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，其特征在于，标准品溶液和质控品同于检测样品的检测步骤进行检测，标准品溶液的浓度选择为：0.1ng/mL-10ng/mL；所述标准品溶液的配置：配制1mg/mL的氰钴胺素甲醇储备液(含0.1％乙酸)，用含0.1％乙酸的甲醇分别稀释至2ng/mL-200ng/mL的工作储备液，分别移取1体积份的上述工作储备液至1.5mL离心管中，分别加入19体积份的μLPBS缓冲液，混匀，制成浓度为0.1ng/mL-10ng/mL的标准曲线。 10.相色谱串联质谱测定维生素B12的试剂盒，其特征在于，包括：该试剂盒采用如权利要求1到9任一所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，测定血清或血浆中维生素B12。
所属类别：	发明专利