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原文传递一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法

专利名称：	一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法
摘要：	本发明公开了一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，属于兽用抗菌药的临床药代动力学领域。本发明方法包括如下步骤：猪尿液加入适量氢氧化钠溶液调节pH至碱性，然后由乙酸乙酯提取，提取物经过浓缩，并以二氯甲烷:丙酮:氨水等于（1‑6）:（4‑9）:（0.05‑0.5）的混合液作为展开液进行薄层色谱净化，再采用高效液相色谱进行检测。本发明以薄层色谱有效地去除了尿液提取物中所含的内源性物质，避免了其对色谱分析的干扰，同时降低了检测成本，减少了有机溶剂的用量。本发明将薄层色谱与高效液相色谱结合起来，弥补了高效液相色谱仪匹配的检测器在特异性上的不足，拓宽了高效液相色谱法在临床药代动力学中的应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉生物工程学院
发明人：	杨波;王前勇;高进东;周丹娜;李亚超
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910091259.4
公开号：	CN109709257A
代理机构：	武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	彭劲松
分类号：	G01N30/90(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	430415 湖北省武汉市新洲区阳逻经济开发区汉施路1号
主权项：	1.一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)准确称取新鲜猪尿液，加入氢氧化钠溶液，涡旋；其中，氢氧化钠溶液的终摩尔浓度为0.5-5N，氢氧化钠溶液和尿液的体积比为(0.01-0.1):(0.5-5)； (2)在碱化后的尿液中加入乙酸乙酯，涡旋，离心，转移乙酸乙酯至另一干净离心管内；其中，碱化后的尿液与乙酸乙酯的体积比为(0.5-5):(5-50)； (3)用等量乙酸乙酯重复上述操作一次，合并乙酸乙酯； (4)分批次转移乙酸乙酯至含适量冰乙酸溶液的离心管内，空气流挥干乙酸乙酯；其中，冰乙酸溶液的体积百分比浓度为1％-10％，体积为0.2-1mL； (5)剩余的冰乙酸溶液涡旋，离心，用空气流吹至体积约0.1mL； (6)将上述冰乙酸溶液、氟苯尼考和氟苯尼考胺混合标准品分别点样于同一块GF-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于(1-6):(4-9):(0.05-0.5)的混合液展开至顶端；所述氨水的体积百分比浓度为25％-28％； (7)将GF-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品的展开距离标记尿液提取液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的大致位置，刮取对应位置的硅胶； (8)于刮取的硅胶中加入乙腈-冰乙酸混合溶液0.5-5mL，涡旋，离心，取上清，通过0.22μm有机相滤膜过滤；其中，乙睛与冰乙酸溶液的体积比为30:70-70:30，所述冰乙酸为体积百分比浓度为1％-10％的冰乙酸溶液； (9)将过滤后的样品通过高效液相色谱检测氟苯尼考胺的含量；其中，高效液相色谱流动相为乙腈与磷酸盐缓冲液按体积比为30:70-70:30组成的混合液；磷酸盐缓冲液中含有质量百分比浓度为3％-10％的十二烷基磺酸钠，1％-4％二水磷酸氢二钠，体积百分比浓度为0.05％-2％的三乙胺和83％-98％的磷酸。 2.根据权利要求1所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，步骤(1)中，涡旋的时间为1-3min。 3.根据权利要求1所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，步骤(2)或(8)中，涡旋的时间为1-3min，离心的条件为3000-8000g离心5-10min。 4.根据权利要求1所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，步骤(4)中：空气流挥干的温度为35-60℃。 5.根据权利要求1所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，步骤(5)中，涡旋的时间为1-3min；离心的条件为3000-8000g离心5-10min，空气流挥干的温度为35-60℃。 6.根据权利要求1所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，步骤(9)中高效液相色谱的条件为：色谱分离在Waters Symmetry C18色谱柱(250mm×4.6mm I.D，5μm)内完成，柱温为32-40℃，流速为0.5-1mL/min，检测波长为220-230nm。 7.根据权利要求1～6任意一项所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)准确量取新鲜猪尿液0.5-5mL,加入0.5-5N的氢氧化钠溶液0.01-0.1mL，涡旋1-3min； (2)在碱化后的尿液中加入乙酸乙酯5-50mL，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，转移乙酸乙酯至另一干净离心管内； (3)用等量乙酸乙酯重复上述操作一次，合并乙酸乙酯； (4)分批次转移乙酸乙酯至含1％-10％的冰乙酸溶液0.2-1mL的离心管内，35-60℃空气流挥干乙酸乙酯； (5)剩余的冰乙酸溶液涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，35-60℃空气流吹至体积约0.1mL； (6)将上述冰乙酸溶液、氟苯尼考和氟苯尼考胺混合标准品分别点样于同一块GF-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于(1-6):(4-9):(0.05-0.5)的混合液展开至顶端； (7)将GF-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品的展开距离标记组织提取液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的大致位置，刮取对应位置的硅胶； (8)于硅胶中加入体积比乙睛:冰乙酸溶液(1％-10％)为30:70-70:30的混合液1-2mL，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，取上清，用0.22μm有机滤膜过滤； (9)过滤后的样品通过高效液相色谱检测氟苯尼考和氟苯尼考胺的量。 8.一种猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺：采用权利要求1～6任意一项所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法中的步骤(1)～(9)； 2)称取含5-20mg氟苯尼考和氟苯尼考胺的标准品加到10mL容量瓶中，用乙睛溶解、定容、摇匀，备用；取供试标品，以步骤1)中第(9)步的流动相逐级稀释成系列浓度，稀释后的标品通过高效液相色谱检测，每浓度标品以10-50μL进样，重复三次，检测条件与步骤1)中第(9)步的高效液相色谱的条件相同，以氟苯尼考或氟苯尼考胺浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到氟苯尼考的回归方程y＝143064x-1045.3和氟苯尼考胺的回归方程y＝275826x+1888.8，其中x为氟苯尼考或氟苯尼考胺浓度，y为峰面积；将步骤1)中第(9)步所测样品经高效液相色谱检测到的氟苯尼考或氟苯尼考胺峰面积带入上述线性方程，经计算即可得到猪尿液中氟苯尼考或氟苯尼考胺残留浓度。 9.一种薄层色谱分离猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，包括权利要求1～6任意一项所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法中的步骤(1)-(8)。 10.权利要求1～6任意一项所述的检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法在检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的应用。
所属类别：	发明专利