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原文传递一种检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法及应用

专利名称：	一种检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法及应用
摘要：	本发明公开了一种检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法及应用。本发明方法包括：猪可食性组织匀浆经过高浓度盐酸溶液水解，乙酸乙酯洗涤，在碱性条件下由乙酸乙酯提取，提取物经过浓缩，正己烷脱脂，并以乙酸乙酯:丙酮:氨水的混合液作为展开液进行薄层色谱净化，再采用高效液相色谱进行检测。本发明充分释放了猪可食性组织中氟苯尼考结合残留物，并将其转化为氟苯尼考胺，避免了现有方法可能导致的“假阴性”结果。此外，本发明以薄层色谱净化组织提取液，有效地去除了组织中所含的内源性物质，避免了其对色谱分析的干扰，降低了检测成本，减少了有机溶剂的用量，结果可靠，适用于基层检测机构进行日常监控。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉生物工程学院
发明人：	杨波;李亚超;周丹娜;王前勇;高进东
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910091751.1
公开号：	CN109709258A
代理机构：	武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	彭劲松
分类号：	G01N30/90(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	430415 湖北省武汉市新洲区阳逻经济开发区汉施路1号
主权项：	1.一种检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)取猪可食性组织，于组织匀浆机中制成匀浆； (2)在组织匀浆中加入高浓度盐酸溶液，涡旋后置于水浴中至组织完全水解；其中，盐酸溶液的终摩尔浓度为4-8N，组织匀浆和盐酸溶液的质量体积比为(1-2)g:(2-8)mL，水浴温度为80-100℃，水浴时间为2-24h；氟苯尼考及代谢物在此条件下完全水解成氟苯尼考胺； (3)待冷却后，在水解后的样品中加入乙酸乙酯，涡旋，离心，弃去乙酸乙酯；其中，水解后的样品与乙酸乙酯的体积比为(3-6):(4-40)； (4)在剩余样品中加入高浓度氢氧化钠溶液调节pH至10-12；其中，氢氧化钠溶液的质量百分比浓度为20％-50％，加入体积为0.5-5mL； (5)在碱化后的样品中加入乙酸乙酯，涡旋，离心，转移乙酸乙酯至另一干净离心管内；其中，碱化后的样品与乙酸乙酯的体积比为(3-8):(4-10)； (6)用等量乙酸乙酯重复上述操作一次，合并乙酸乙酯； (7)分批次转移乙酸乙酯至含适量冰乙酸溶液的离心管内，空气流挥干乙酸乙酯；其中，冰乙酸溶液的体积百分比浓度为1％-10％，体积为0.2-1mL； (8)在剩余的冰乙酸溶液中加入适量正己烷，涡旋，离心，弃去正己烷；其中，剩余冰乙酸溶液和正己烷的体积比为(0.2-1):(4-10)； (9)将剩余的冰乙酸溶液用空气流吹至体积约0.1mL； (10)将上述冰乙酸溶液和氟苯尼考胺标准品分别点样于同一块GF-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比乙酸乙酯:丙酮:氨水等于(1-5):(5-9):(0.05-0.5)的混合液展开至顶端；所述的氨水的体积百分比浓度优选为25％-28％； (11)将GF-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氟苯尼考胺标准品的展开距离标记组织提取液中氟苯尼考胺的大致位置，刮取对应位置的硅胶； (12)于刮取的硅胶中加入体积比20:80-80:20的乙腈-冰乙酸混合液0.5-5mL，涡旋，离心，取上清，通过滤膜过滤，滤膜优选为0.22μm有机滤膜；其中，乙腈-冰乙酸混合溶液中冰乙酸的体积百分比浓度为1％-10％； (13)将过滤后的样品通过高效液相色谱检测氟苯尼考胺的含量；其中，高效液相色谱流动相为乙腈与磷酸盐缓冲液按体积比为30:70-70:30组成的混合液；磷酸盐缓冲液中含有质量百分比浓度为3％-10％的十二烷基磺酸钠，1％-4％二水磷酸氢二钠，体积百分比浓度为0.05％-2％的三乙胺和83％-98％磷酸。 2.根据权利要求1所述的检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法，其特征在于，步骤(1)中组织匀浆的转数为3000-10000r/min，时间为2-5min。 3.根据权利要求1所述的检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法，其特征在于，步骤(2)中：涡旋的时间为1-3min。 4.根据权利要求1所述的检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法，其特征在于，步骤(3)、(5)、(8)中涡旋的时间为1-3min；离心的条件为3000-8000g离心5-10min。 5.根据权利要求1所述的检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法，其特征在于，步骤(7)、(9)中空气流挥干的温度为35-60℃。 6.根据权利要求1所述的检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法，其特征在于，步骤(13)中高效液相色谱的条件为：色谱分离在Waters Symmetry C18色谱柱(250mm×4.6mm I.D，5μm)内完成，柱温为32-40℃，流速为0.5-1mL/min，检测波长为220-230nm。 7.根据权利要求1～6任意一项所述的检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)猪可食性组织制成匀浆； (2)称取组织匀浆2-5g，加入4-8N的盐酸溶液2-16mL，涡旋1-3min，置于水浴90-100℃中水浴6-12h；氟苯尼考及其代谢物在此条件下完全水解成氟苯尼考胺； (3)样品冷却至室温，然后加入乙酸乙酯8-40mL，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，弃去乙酸乙酯； (4)在剩余样品中加入质量百分比浓度为20％-50％的氢氧化钠溶液0.5-5mL调节pH至10-12； (5)在碱化后的样品中加入乙酸乙酯5-20mL，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，转移乙酸乙酯至另一干净离心管内； (6)用等量乙酸乙酯重复上述操作一次，合并乙酸乙酯； (7)分批次转移乙酸乙酯至含0.2-1mL体积百分比浓度为1％-10％的冰乙酸溶液的离心管内，于35-60℃空气流挥干乙酸乙酯； (8)在剩余的冰乙酸溶液中加入2-10mL正己烷，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，弃去正己烷； (9)剩余的冰乙酸溶液于35-60℃空气流吹至体积约0.1mL； (10)将上述冰乙酸溶液和氟苯尼考胺标准品分别点样于同一块GF-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比乙酸乙酯:丙酮:氨水等于(1-5):(5-9):(0.05-0.5)的混合液中展开至顶端； (11)将GF-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氟苯尼考胺标准品的展开距离标记组织提取液中氟苯尼考胺的大致位置，刮取对应位置的硅胶； (12)于硅胶中加入体积比乙睛:冰乙酸溶液(1％-10％)为20:80-80:20的混合液0.5-5mL，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，取上清，用0.22μm有机滤膜过滤； (13)过滤后的样品通过高效液相色谱检测氟苯尼考胺的量，以氟苯尼考胺的量代表氟苯尼考总残留物的量。 8.一种猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物：采用权利要求1～6任意一项所述的检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法中的步骤(1)～(13)； 2)称取5-20mg氟苯尼考胺的标准品加到10mL容量瓶中，用乙睛溶解、定容、摇匀，备用；取供试标品，以步骤1)中第(13)步流动相逐级稀释成系列浓度，每浓度标品以10-50μL进样，重复三次，以氟苯尼考胺浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到回归方程y＝282116x+9413.7，其中x为氟苯尼考胺浓度，y为峰面积；将步骤1)中第(13)步所测样品经高效液相色谱检测到的氟苯尼考胺峰面积带入上述线性方程，经计算即可得到猪可食性组织中氟苯尼考胺残留浓度。 9.一种薄层色谱分离猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法，其特征在于，包括权利要求1～7任意一项所述方法中的步骤(1)-(12)。 10.权利要求1～7任意一项所述的检测猪可食性组织中氟苯尼考总残留物的方法在检测猪可食性组织中氟苯尼考的残留的应用。
所属类别：	发明专利