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原文传递一种干血斑及其它微量生物样品的代谢组分析方法

专利名称：	一种干血斑及其它微量生物样品的代谢组分析方法
摘要：	本发明属于生物分析技术领域，具体为一种干血斑及其它微量生物样品的代谢组分析方法。本发明步骤包括：干血斑样本代谢物提取；干血斑全局性非靶向代谢组学分析；其中，采用UHPLC‑QTOF‑MS对DBS样本进行非靶向代谢表型分析；采用RPLC和HILIC色谱分离模式及电喷雾离子化（ESI）正负离子质谱检测模式，对干血斑代谢物组成进行分析。本发明极大程度降低了样品在前处理等过程中代谢物损失及金属离子对分析物的影响，具有高通量、高灵敏度及代谢物高覆盖的特点，可应用于分子流行病学病因筛查及致病机制等分析研究。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	复旦大学
发明人：	唐惠儒;芦勤玮
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201811575739.X
公开号：	CN109738530A
代理机构：	上海正旦专利代理有限公司
代理人：	陆飞;陆尤
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200433 上海市杨浦区邯郸路220号
主权项：	1.一种DBS及其它微量生物样品的代谢组检测分析方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1、DBS或其它微量生物样本代谢物提取；步骤2、DBS或其它微量生物样本全局性非靶向代谢组分析：采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用法，记为UHPLC-QTOF-MS，对DBS样本进行非靶向代谢表型分析；采用反相液相色谱和电喷雾离子化正负离子模式质谱进行代谢组分析；采用亲水作用液相色谱和电喷雾离子化正负离子模式质谱进行代谢组分析；这里，DBS表示干血斑，所述其他微量生物样本包括生物体液、细胞样品和生物组织。 2. 根据权利要求1所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，对于DBS测试样品，步骤1流程为：血试纸样品使用3~6mm打孔机打孔，将2张面积相同的干血斑放置于2 mL离心管中，精确加入80~150μL含2~3%甲酸的体积比70~80%预冷甲醇水，涡旋振荡混合均匀10~30s，在冰水中超声，超声步骤为1 min超声，1 min停止，共10~15个循环；在室温下静置10~30min；在4℃，10000~16000 g条件下离心5~15 min；将上清液使用孔径0.22 μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20 ℃~-80 ℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测；从所有待测样品中各取5~10 μL混合，作为质控样品QC，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。 3. 根据权利要求1所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，对于生物体液测试样品，步骤1流程为：将生物体液样本于冰上或4 ℃冰箱中解冻摇匀，用移液枪吸取10~20 μL生物体液样本于1.5 mL离心管中，加入3~5倍于生物体液体积含2~3% 甲酸FA的预冷甲醇，涡旋振荡混合均匀1~3 min，进行5~15 min离心，将上清液使用孔径0.22 μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20 ℃~-80 ℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测；从所有待测样品中各取5~10 μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。 4. 根据权利要求1所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，对于细胞测试样品，步骤1的流程为：称取10~20 mg的细胞样品加入到2mL EP管中；加入500 μL的体积比70~80%预冷甲醇水溶液，使用液氮反复冻融三次，涡旋振荡混合均匀1~3 min，在冰水中超声，超声步骤为1 min超声，1 min停止，共10~15个循环，进行5~15 min离心；取上清液于EP管中暂存，将下层细胞样品沉淀重复进行以上提取步骤2~3次，将每次的上清液混合并去除溶剂，最后使用100~150μL的体积比70~80%预冷甲醇水溶液复溶，并使用孔径0.22 μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20 ℃~-80 ℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测；从所有待测样品中各取5~10 μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。 5. 根据权利要求1所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，对于生物组织测试样品，步骤1流程为：准确称取10~20 mg的组织样品加入到2mL EP管中，并逐个放入研磨珠；加入600μL的体积比70~80%预冷甲醇水溶液；在组织破碎仪中以10~20 Hz进行破碎1~2min，取出样品在冰水中超声，超声步骤为1 min超声，1 min停止，共10~15个循环，进行5~15min离心；取上清液于EP管中暂存，将下层组织样品沉淀重复进行以上提取步骤2~3次，将每次的上清液混合并去除溶剂，最后使用100~150 μL的体积比70~80%预冷甲醇水溶液复溶，并使用孔径0.22 μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20 ℃~-80 ℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测；从所有待测样品中各取5~10 μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。 6.根据权利要求1~5之一所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，步骤2中，所述的色谱条件如下：反相色谱柱使用亚2 μm C18填料的色谱柱，保护柱使用在线过滤器，流动相由记为A相的含0.1%甲酸的超纯水和记为B相的含0.1%甲酸的乙腈组成，梯度程序为：0 min，1% B；1min，1% B；3 min，15% B；6 min，50% B；9 min，95% B；14.0 min，95% B；每次进样前在初始条件下平衡5~10 min，流速0.4~0.5 mL/min，柱温25~45℃，进样量1~3 μL；亲水作用色谱柱使用亚2 μm 亲水作用色谱柱，保护柱使用在线过滤器，流动相由记为C相的含0.3%甲酸+2 mM甲酸铵的超纯水和记为D相的含0.3%甲酸+2mM甲酸铵的95%色谱纯乙腈水组成，梯度程序为：0 min，100% D；1 min，100% D；12 min，50% D；17 min，50% D；每次进样前在初始条件下平衡5~10 min，流速0.4~0.5 mL/min，柱温25~45℃，进样量1~3 μL；所述的质谱条件如下：质谱在ESI+和ESI-两种采样模式下分别进行分析测定，质谱仪鞘气温度为250~400℃，流速为7~12L/min；干燥气流速为250~400℃，流速为7~12L/min；采集频率为2~4质谱图/秒；正离子检测模式下，毛细管电压为2000~4000 V，喷嘴电压为200~500 V，雾化器压力为20~50psi；负离子检测模式下，毛细管电压为-2000~-3500 V，喷嘴电压为-1000~-1500 V，雾化器压力为20~50psi；还分别采集质控样品在碰撞能为10、20和40 V条件下的质谱数据，所得母离子及碎片离子作为代谢物定性依据。 7. 根据权利要求6所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，所述反相色谱柱可选用Waters Acquity UPLC® HSS T3，保护柱可选用Waters Acquity UPLC® HSS T3VanGuard Pre-Column；所述亲水色谱柱可选用Waters Acquity UPLC® BEH Amide，保护柱可选用WatersAcquityUPLC® BEH Amide VanGuard Pre-Column。
所属类别：	发明专利