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原文传递一种高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法

专利名称：	一种高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法
摘要：	本发明属于蛋白质分析技术领域，具体为一种高通量简易细胞O‑糖基化位点的富集、鉴定方法。本发明方法包括：通过在细胞培养环境中加入O‑GalNAc糖链合成抑制剂，使O‑GalNAc糖链合成抑制在单个GalNAc的水平；然后通过超滤辅助凝集素富集技术实现O‑GalNAc糖肽的富集，利用单糖竞争机制释放富集到的O‑糖肽；最后通过LC‑MS，高通量鉴定O‑GalNAc糖基化位点。本发明解决了因为O‑糖链释放酶的缺失和无保守的修饰位点序列等原因带来的O‑GalNAc位点高通量鉴定困难的问题，通过抑制剂简化O‑糖链策略、超滤辅助凝集素亲和富集技术，实现了O‑GalNAc位点的大规模鉴定。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	复旦大学
发明人：	黄江铭;曹纬倩;蒋碧云;杨芃原
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-31T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201811650406.9
公开号：	CN109738533A
代理机构：	上海正旦专利代理有限公司
代理人：	陆飞;陆尤
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200433 上海市杨浦区邯郸路220号
主权项：	1.一种高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）通过在细胞培养环境中加入O-GalNAc糖链合成抑制剂，使O-GalNAc糖链合成抑制在单个GalNAc的水平；（2）然后通过超滤辅助凝集素富集技术实现O-GalNAc糖肽的富集，利用单糖竞争机制释放富集到的O-糖肽；（3）最后通过LC-MS，高通量鉴定O-GalNAc糖基化位点。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体操作流程为：（1）将O-糖链合成抑制剂加入细胞培养基中；（2）细胞在含抑制剂的培养基中培养；（3）弃去培养基，用PBS清洗3次后进行常规的细胞收集、蛋白裂解和胰酶酶解；（4）加入PNGase F和唾液酸酶去除N-糖链和唾液酸；（5）用C18小柱对酶解后的肽段除盐，随后冻干；（6）将凝集素与除盐后的肽段一起孵育；（7）将孵育后的凝集素溶液转移至超滤管，进行超滤，并清洗5次以上，洗去未与凝集素结合的非糖蛋肽；（8）在体系中加入终浓度0.1~1mol/L的GalNAc，孵育0.5~2 h，通过单糖竞争作用，将与凝集素结合的O-糖肽释放下来；（9）超滤，并清洗2~5次，合并收集的O-糖肽和GalNAc的混合溶液；（10）通过C18小柱除盐除去体系中的盐和GalNAc，随后冻干；（11）做LC-MS分析，鉴定O-GalNAc糖基化位点。 3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所使用的O-糖链合成抑制剂为Benzyl2-acetamido-2-deoxy–α -D-galactopyranoside。 4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，流程（1）中加入抑制剂的浓度为1~10mM。 5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，流程（2）中，所述细胞在抑制剂环境下培养的时间为24~48h。 6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，流程（4）中，加入的PNGase F和唾液酸酶以300~500 U对应1 mg起始蛋白的比例加入，37℃孵育14~18小时。 7. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，流程（6）中，加入的凝集素为长柔毛野豌豆外源凝集素，加入的浓度为1~5 微克/微升；室温孵育，孵育时间为0.5~3 h，孵育以及超滤的溶液为10~100 mMTris/HCl pH为7~8,0~2mM MnCl2, 0~2mM CaCl2, 0~2 MNaCl。
所属类别：	发明专利