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原文传递检测非洲猪瘟病毒的分子探针、试剂盒及其应用

专利名称：	检测非洲猪瘟病毒的分子探针、试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的分子探针、试剂盒及其应用，旨在解决现有检测技术可靠性和实用性差的技术问题。本发明检测非洲猪瘟病毒的分子探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明配制了一种检测非洲猪瘟病毒的RT‑PCR反应液，制备了一种检测非洲猪瘟病毒RT‑PCR反应液冻干粉、一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，并提供了非洲猪瘟病毒的定性和定量检测方法。本发明设计的分子探针及建立RT‑PCR检测方法具有敏度性高、重复性好、特异性强的特点，提高PCR技术检测ASFV的可靠性和易用性，实现无污染、高通量的检测，可用于检测易感动物及相关动物制品中ASFV核酸。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南中泽生物工程有限公司
发明人：	王爱萍;张改平;刘运超;贾蕊;刘东民;赵建国;祁元明;石海宁
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910088473.4
公开号：	CN109781981A
代理机构：	河南科技通律师事务所
代理人：	张晓辉;樊羿
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	451162 河南省郑州市航空港区迎宾路南侧4号楼1-2层
主权项：	1.一种检测非洲猪瘟病毒的分子探针，其特征在于，其核苷酸序列为： 5'-X-CCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCC-3'-Y，所述X为荧光报告基团，Y为荧光淬灭基团。 2.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的分子探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET中的任意一个。 3.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的分子探针，其特征在于，所述荧光淬灭基团为TAM-RA或BHQ。 4.一种检测非洲猪瘟病毒的RT-PCR反应液，其特征在于，每22μL所述RT-PCR反应液由5pmol的权利要求1所述分子探针1μL，50 pmol 的引物ASFV-For 1μL，50 pmol的引物ASFV-Back 1μL，TaqMan reaction mix 12.5μL和Nuclease-free water 6.5μL组成；所述引物ASFV-For的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物ASFV-Back的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 5.一种检测非洲猪瘟病毒RT-PCR反应液冻干粉，其特征在于，其制备方法为：（1）配制Reaction Mixer；每11.5mL Reaction Mixer由5 pmol的权利要求1所述分子探针 500 μL，TaqManreaction mix 6250μL，50 pmol 的引物ASFV-For 500 μL，50 pmol的引物ASFV-Back 500μL和Nuclease-free water 3750μL组成；所述引物ASFV-For的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物ASFV-Back的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；（2）取所配制的Reaction Mixer按照每瓶1 mL的量分装至容量为10mL的安培瓶中，再避光冻干成粉末；（3）将所得粉末置于-40～-80℃保存。 6.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，含有权利要求1所述分子探针、权利要求4所述RT-PCR反应液或权利要求5所述RT-PCR反应液冻干粉。 7.权利要求6所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待检样品DNA；（2）取权利要求6所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的RT-PCR反应液或将RT-PCR反应液冻干粉按照1mL Nuclease-free water每瓶的量稀释，得稀释反应液；（3）取3μL所述样品DNA加入22μL所述反应液或所述稀释反应液中进行RT-PCR反应；（4）取RT-PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳；（5）若RT-PCR检测的Ct值>40或电泳无扩增曲线，则待检样品为阴性；若RT-PCR检测的Ct值<40且电泳有258bp的扩增曲线，则待检样品为阳性。 8.根据权利要求7所述的非洲猪瘟病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述RT-PCR反应的反应程序为：1个循环 50 ℃ 2 min，1个循环 95 ℃ 10 min，40个循环 95 ℃15 second，58 ℃ 1 min。 9.权利要求6所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取定量用标准品进行倍比稀释；（2）提取待检样品DNA；（3）取权利要求6所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的RT-PCR反应液或将RT-PCR反应液冻干粉按照1mL Nuclease-free water每瓶的量稀释，得稀释反应液；（4）取3μL所述倍比稀释标准品和所述待检样品DNA加入22μL所述反应液或所述稀释反应液中进行RT-PCR反应；（5）根据已知标准品浓度，计算出各个稀释度对应的核酸拷贝数；（6）以定量用标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，以RT-PCR检测的Ct值为X轴，作标准曲线；（7）将待检样品的Ct值代入标准曲线的线性回归方程中，即计算出其核酸拷贝数，即得其核酸浓度。 10.根据权利要求9所述的非洲猪瘟病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述RT-PCR反应的反应程序为：1个循环 50 ℃ 2 min，1个循环 95 ℃ 10 min，40个循环 95 ℃15 second，58 ℃ 1 min。
所属类别：	发明专利