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原文传递一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法

专利名称：	一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法
摘要：	本发明公开了一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法，包括以下步骤：A、纳米孔的制备；B、纳米孔的修饰及单分子酶传感器构建；C、关键步骤的表征；D、底物特异性传感检测；E、信号提取及分析。本发明结合固态纳米孔稳定、易于设计加工与物化改性的优点，构建出可控制的，稳定的，高灵敏度的纳米孔内单分子辣根过氧化物酶传感器件。通过纳米孔内外差异化修饰，研究辣根过氧化物酶单分子在纳米孔内的可控修饰；通过研究纳米孔电流特征信号与单分子酶反应过程相关性以及纳米孔内单分子酶促动力学相关参数，解释单分子酶催化机制。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南通大学
发明人：	谭生伟;陆祖宏;刘全俊
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201910150278.X
公开号：	CN109856227A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	汤东凤
分类号：	G01N27/48(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	226500 江苏省南通市崇川区啬园路9号
主权项：	1.一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法,其特征在于：包括以下步骤： A、纳米孔的制备； B、纳米孔的修饰及单分子酶传感器构建； C、关键步骤的表征； D、底物特异性传感检测； E、信号提取及分析。 2.根据权利要求1所述的一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法，其特征在于：所述步骤A中采用10-100nm超薄氮化硅膜；通过对TEM、FIB、HIM加工系统平台中的聚焦电子束或离子束加工条件的优化，制备多种厚度、孔径以长径比，形状的纳米孔。 3.根据权利要求1所述的一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法，其特征在于：所述步骤B中用多种硅烷化处理实现纳米孔表面和内壁的差异化修饰改性，通过硅烷偶联分子将过氧化物酶偶联在纳米孔内壁；其中，硅烷采用甲基硅烷、三氟硅烷或羧基硅烷。 4.根据权利要求1所述的一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法，其特征在于：所述步骤C中通过SEM,TEM,AFM对纳米孔形态结构进行表征，接触角测量仪、伏安电流曲线、SEM、TEM技术手段对纳米孔化学改性进行表征，使用纳米孔内电流信号变化判断孔内过氧化物酶分子结合的速度，数量。 5.根据权利要求1所述的一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法，其特征在于：所述步骤D中将不同浓度过氧化氢加入反应体系，分析电流特征信号，画出过氧化氢浓度标准曲线，测量传感器对过氧化氢的检测极限，通过加入底物类似物，检测电学信号变化，比较底物与类似物之间电流信号的差异，分析差异的来源与机理，继而通过检测影响酶反应动力学参数Km和Kcat，实现单分子酶催化机制的研究。 6.根据权利要求1所述的一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法，其特征在于：所述步骤E中利用2,2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐，在过氧化氢的存在下，辣根过氧化酶HRP被氧化的产物Compound I.卟啉阳离子自由基化合物从还原态的底物分子接受一个电子生成的化合物Compound II，然后，compound II经过一个电子的传递被还原成resting enzyme，作为底物，利用反应过程中的电信号变化，检测酶反应速率。 7.根据权利要求6所述的一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法，其特征在于：分析步骤为：将单个辣根过氧化物酶稳定的组装固定在纳米孔孔壁内，通过对特征电流信号的分析，结合相关数学物理模型，确定因酶促反应而产生的特征信号，测量底物的检测极限；区分底物，底物催化产物，竞争底物等电流特征信号的不同，并用特征信号进行酶促动力学参数的测量。
所属类别：	发明专利